Файл: Лабораторные работы биобезопасность биотехнологических производств.doc
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.11.2023
Просмотров: 53
Скачиваний: 1
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
0С 48 час. Из подозрительных на стафилококк колоний выделяют чистую культуру на скошенном агаре. После 24 час инкубации при 370С проверяют плазмокоагулирующую активность культуры.
При необходимости установления источника возникновения стафилококковой инфекции и путей ее распространения проводят фаготипирование культуры.
Подсчитывают количество выросших колоний стафилококка в 1 м3 воздуха.
Определение стрептококков
Отбор проб воздуха при исследовании на наличие - и -гемолитических стрептококков проводят аппаратом Кротова на чашках Петри с кровяным агаром. Исследуют 250 л воздуха. Посевы выдерживают в термостате 24 час, а затем еще 48 час при комнатной температуре. Подсчет количества выросших колоний проводят на 1 м3 с последующим контрольным микроскопированием и выборочным пересевом колоний на кровяной агар или сахарный бульон.
Таблица 1
Критерии оценки воздуха жилых помещений
Таблица 2
Критерии оценки воздуха лечебно-профилактических учреждений
Молочно-солевой агар
К 1л расплавленного мясо-пептонного агара рН 7,2-7,4, содержащего 5-7,5г хлорида натрия, добавляют 10мл стерильного теплого хорошо обезжиренного молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки.
Микрофлора воды
Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микробному числу - количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру - наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу - количеству БГКП в 1 л воды. Кроме того, в воде определяют наличие энтерококков, сальмонелл, энтеровирусов. Согласно ГОСТу на питьевую водопроводную воду, ее коли-титр должен быть не менее 300 мл, коли-индекс - не более 3, общее микробное число - не более 100.
Нормативы: ОМЧ не более 100, коли-титр - 333 мл, коли-индекс не более 3.
Метод мембранных фильтров
Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объеме 500 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП.
Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadасеае и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-пфенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.
Микрофлора почвы
Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы, с преобладанием санитарно-показательных бактерий, расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненными фекалиями человека или животных. Присутствие в почве Е. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее, бактерий родов Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, a Clostridium perfringens - на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1г почвы, перфрингенс-титра - масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общей численности сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1г почвы.
Нормативы: чистая почва: коли-титр - 1 и выше; перфрингенс-титр - 0,01 и выше; ОМЧ- 100-1000.
Загрязненная почва: коли-титр - 0,9 - 0,01; перфрингенс-титр - 0,009-0,0001; ОМЧ-1000-100000.
Сильно загрязненная почва: коли-титр - 0,009 и ниже; перфрингенс-титр -0,00009 и ниже; ОМЧ - 10000-4000000.
Ход исследования. ОМЧ. Почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10"3, 10"4, 10"5. Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45°С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.
Определение коли-титра, перфрингенс-титра.
Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера (1л дистиллированной воды, 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи, 10 г лактозы; рН 7,4-7,6; 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового). Разливают в пробирки с поплавками. Инкубируют при 43°С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках Гр- палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная (изменение окраски на синий цвет) проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие Е. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП.
Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. Инкубация при 43°С 48 часов. Учитывают результаты по образованию черных колоний Cl. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (Гр+ крупные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды впервые 12 часов роста при 430 С).
Микрофлора рук и предметов окружающей среды
Санитарный надзор за состоянием объектов общественного питания и пищеблоков в лечебных и детских учреждениях осуществляется взятием смывов с рук обслуживающего персонала, с посуды, поверхности столов, досок и т. д. При взятие смыва с рук пользуются стерильными ватными тампонами, которые перед употреблением смачивают в среде Кесслера, содержащейся в пробирке, в которой находится тампон. Смывы делают с обеих рук, тщательно протирая ладони, межпальцевые промежутки и подногтевые пространства сначала левой руки, а затем правой. Смывы с поверхности предметов делают с помощью трафаретов из проволоки, имеющих площадь 25 см
2. Посевы выдерживают в термостате при температуре 43° С в течение суток. При наличии брожения в среде Кесслера делают высев на среду Эндо. Колонии, подозрительные на кишечную палочку, подвергают дальнейшей идентификации.
При необходимости установления источника возникновения стафилококковой инфекции и путей ее распространения проводят фаготипирование культуры.
Подсчитывают количество выросших колоний стафилококка в 1 м3 воздуха.
Определение стрептококков
Отбор проб воздуха при исследовании на наличие - и -гемолитических стрептококков проводят аппаратом Кротова на чашках Петри с кровяным агаром. Исследуют 250 л воздуха. Посевы выдерживают в термостате 24 час, а затем еще 48 час при комнатной температуре. Подсчет количества выросших колоний проводят на 1 м3 с последующим контрольным микроскопированием и выборочным пересевом колоний на кровяной агар или сахарный бульон.
Таблица 1
Критерии оценки воздуха жилых помещений
| Оценка воздуха | Общее количество бактерий в 1 м3 | Количество стрептококков |
| Лето чистый загрязненный | до 1500 до 2500 | до 16 до 36 |
| Зима чистый загрязненный | до 4500 до 7000 | до 36 до 124 |
Таблица 2
Критерии оценки воздуха лечебно-профилактических учреждений
| Наименование объекта | Условия работы | Допустимые показатели в 1 м3 | ||
| микробное число | патогенных стафилококков | стрептококков | ||
| Операционная | до операции после операции | до 500 до 1000 | не должно быть не должно быть | не должно быть не должно быть |
| Послеоперационные палаты | | до 750 | не должно быть | не должно быть |
| Отделение реанимации | | до 750 | не должно быть | не должно быть |
| Родильные залы | при поступлении рожениц, приеме родов | до 1500 | не должно быть | не должно быть |
| Послеродовые палаты | | до 2000 | до 16 суммарно | |
| Палаты новорожденных | | до 1500 | до 12 суммарно | |
| Перевязочные | до начала работ | до 750 | не должно быть | не должно быть |
| Послеоперационные палаты | летом зимой | до 3500 до 5000 | до 24 до 52 | до 16 до 36 |
Молочно-солевой агар
К 1л расплавленного мясо-пептонного агара рН 7,2-7,4, содержащего 5-7,5г хлорида натрия, добавляют 10мл стерильного теплого хорошо обезжиренного молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки.
Микрофлора воды
Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микробному числу - количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру - наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу - количеству БГКП в 1 л воды. Кроме того, в воде определяют наличие энтерококков, сальмонелл, энтеровирусов. Согласно ГОСТу на питьевую водопроводную воду, ее коли-титр должен быть не менее 300 мл, коли-индекс - не более 3, общее микробное число - не более 100.
Нормативы: ОМЧ не более 100, коли-титр - 333 мл, коли-индекс не более 3.
Метод мембранных фильтров
Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объеме 500 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП.
Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadасеае и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-пфенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.
Микрофлора почвы
Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы, с преобладанием санитарно-показательных бактерий, расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненными фекалиями человека или животных. Присутствие в почве Е. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее, бактерий родов Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, a Clostridium perfringens - на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1г почвы, перфрингенс-титра - масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общей численности сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1г почвы.
Нормативы: чистая почва: коли-титр - 1 и выше; перфрингенс-титр - 0,01 и выше; ОМЧ- 100-1000.
Загрязненная почва: коли-титр - 0,9 - 0,01; перфрингенс-титр - 0,009-0,0001; ОМЧ-1000-100000.
Сильно загрязненная почва: коли-титр - 0,009 и ниже; перфрингенс-титр -0,00009 и ниже; ОМЧ - 10000-4000000.
Ход исследования. ОМЧ. Почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10"3, 10"4, 10"5. Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45°С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.
Определение коли-титра, перфрингенс-титра.
Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера (1л дистиллированной воды, 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи, 10 г лактозы; рН 7,4-7,6; 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового). Разливают в пробирки с поплавками. Инкубируют при 43°С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках Гр- палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная (изменение окраски на синий цвет) проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие Е. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП.
Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. Инкубация при 43°С 48 часов. Учитывают результаты по образованию черных колоний Cl. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (Гр+ крупные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды впервые 12 часов роста при 430 С).
Микрофлора рук и предметов окружающей среды
Санитарный надзор за состоянием объектов общественного питания и пищеблоков в лечебных и детских учреждениях осуществляется взятием смывов с рук обслуживающего персонала, с посуды, поверхности столов, досок и т. д. При взятие смыва с рук пользуются стерильными ватными тампонами, которые перед употреблением смачивают в среде Кесслера, содержащейся в пробирке, в которой находится тампон. Смывы делают с обеих рук, тщательно протирая ладони, межпальцевые промежутки и подногтевые пространства сначала левой руки, а затем правой. Смывы с поверхности предметов делают с помощью трафаретов из проволоки, имеющих площадь 25 см
2. Посевы выдерживают в термостате при температуре 43° С в течение суток. При наличии брожения в среде Кесслера делают высев на среду Эндо. Колонии, подозрительные на кишечную палочку, подвергают дальнейшей идентификации.