ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 26.10.2023
Просмотров: 279
Скачиваний: 6
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
БИОТЕХНОЛОГИЯ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Стероиды – это вещества, обладающие высокой биологической активностью, в основе структуры которых лежит скелет циклапентанпергидрофенантрена (гонана, стерана).
К стероидам относятся:
• витамины D
• желчные кислоты
• сапонины
• сердечные гликозиды
• стероидные алкалоиды
• стероидные гормоны
-
глюкокортикоиды (гидрокортизон, кортизон); -
минералокортикоиды (альдостерон); -
женские половые гормоны – эстроген, прогестерон, экстрадиол); -
мужские половые гормоны – тестостерон, дигидротестостерон, андростендион)
ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ПРИРОДНЫХ СТЕРОИДОВ
Для природных стероидов характерно присутствие
• при С-3 – гидроксильной группы или кетогруппы (эстрогены)
• при С-17 – карбонильная или гидроксильная группа (андрогены и эстрогены); боковая углеродная цепь;
• у кортикостероидов – наличие кислородной группы при С-11;
• стероидные соединения различаются числом и месторасположением заместителей (гидроксильной, аминной, карбонильной группы) в ядре и появления или исчезновения двойных связей.
Стероиды обнаружены практически во всех организмах. Способность к биосинтезу стероидов наиболее выражена у высших позвоночных. Насекомые стероиды не вырабатывают, а получают с пищей, однако функция их линьки контролируется стероидами.
БИОСИНТЕЗ СТЕРОИДОВ
Все стероиды объединяются одной схемой биогенеза.
Предшественником стероидных гормонов является холестерин. Он синтезируется в основном в печени.
Ас-КоА → мевалоновая кислота → изопреновые фрагменты(изопентенилпирофосфат и изомерный ему диметилаллилпирофосфат) → сквален → ланостерин → холестерин.
Транспортируется холестерин липопротеидами (ЛНП, ЛОНП, ЛВП, ХМ).
Деградация
стероидных гормонов происходит в основном в печени. Их ОН-группы обычно связаны с сульфатом или глюкуроновой кислотой и экскретируются в желчь или мочу.
Проблема сырья для получения стероидных препаратов
Стероиды можно получить из:
• спинного мозга и желчи рогатого скота,
• щелочного гидролизата дрожжей,
• растительных масел
• животных жиров,
• отходов целлюлозо-бумажного производства,
• растений
• культуры клеток растений;
• синтезируют из неприродного сырья;
• микробиологической трансформацией уже имеющего стероида
(с использованием бактерий и грибов)
виды стероидного сырья
• Эргостерин является провитамином витамина Д. Особенно много эргостерина в пекарских дрожжах.
• Стигмастеринсодержится в большом количестве соевом масле, в сахарном тростнике.
• β-ситостерин.Содержится во всех растениях и в отходах древесины. Коммерческий источник: тростник и хлопковое масло.
Стигмастерин и ситостерины – наиболее перспективные и дешевые исходные продукты для получения стероидных препаратов.
• Соласодинсодержится в паслене дольчатом(Solanum laciniatum), который растет в Казахстане. Однако производство соласодина нерентабельно, поэтому недостаток исходного сырья для медицинской промышленности восполняется за счет импортируемого диосгенина.
• Диосгенинсодержится в растении диоскорее – это дорогое импортное сырье. В качестве сырья для его получения используют корневища дикорастущих и культивируемых видов диоскореи с высоким содержанием этого стероида. Также в качестве промышленного сырья за рубежом используются агавы, различные виды паслена, пажитника, юкки.
Экономически выгодный источник для получения диосгенина: диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea), в ее корневищах – до 6% этого стероида.
В последние годы перспективный источник диосгенина – высокопродуктивные штаммы суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной, содержащие до
10% стероидных гликозидов.
Проблема селективного отщепления боковых цепей стероидов
При использовании фитостеринов необходимо добиться селективного удаления насыщенной алифатической боковой цепи и сохранением ядра (скелета) молекулы. Решение:
1. синтез модифицированных стеринов, ограничивающих действие микроорганизмов (заместители в кольце А или В которых не позволяют микроорганизмам осуществлять 1,2-дегидрирование или 9α-гидроксилирование)
2. инкубация стеринов в присутствии соединений, ингибирующих действие ферментов гидролаз (9α-гидроксилазы или 1,2-дегидрогеназы),
3. получение мутантных штаммов ограниченного действия на стероидное ядро.
БИОКОНВЕРСИЯ (БИОТРАНСФОРМАЦИЯ)
Микробиологическая трансформация стероида – это использование ферментативной активности микроорганизмов для селективного изменения стероида. Микроорганизмы могут влиять только на отдельные (единичные) стадии довольно сложных и длительных процессов химического синтеза.
Преимущества использования микробиологической трансформации:
• мягкие условия протекания;
• значительноупрощается синтез лекарственных средств (меньше стадий);
• появляется возможность осуществления тех реакций, которые достаточно трудны или вообще не осуществимы в химическом синтезе;
• небольшое количество вредных для биосферы отходов и побочных продуктов;
• позволяет осуществлять рентабельный промышленный синтез лекарственных средств (пример промышленного синтеза гидрокортизона, преднизолона, дексаметазона, осуществленного только после разработки микробиологических способов их получения).
Недостатки микробиологических методов по сравнению с химическими:
• ферменты функционируют в большинстве случаев в водной среде, а большинство субстратов, как правило, плохо растворимы в воде. Поэтому в процессах приходится использовать растворы низкой концентрации, что приводит к низкому выходу целевого продукта с единицы объема аппарата.
• Трудности, связанные с культивированием микроорганизмов (необходимость асептических условий, интенсивного массообмена и обработки больших количеств микробной массы или культуральной среды, загрязнением целевого продукта биотрансформации питательными веществами и продуктами их метаболизма и др.)
• крупнотоннажное производство на основе методов микробиологической трансформации требует высоких энергетических затрат.
Иногда для биоконверсии требуются смешанные культуры или последовательное добавление микробных штаммов или видов, каждый из которых осуществляет специфическую стадию биоконверсии.
К основным процессам микробиологической трансформации относятся: окисление, восстановление, гидролиз, дегидрирование, декарбоксилирование, дезаминирование, образование гликозидов, метилирование, ацетилирование и др. В определении скорости и направления реакции главную роль играют положение и ориентация замещающих групп в молекуле стероидов.
История развития микробиологической трансформации стероидов
Еще в конце Х1Хв. стало известно, что бактериальная флора кишечника млекопитающих превращает холестерин в копростерин, а холевую кислоту в дезоксихолевую.
В 1908 году была открыта способность кишечной палочки (E.coli) окислять гидроксильные группы стероидных соединений.
В 1948 году впервые осуществили введение гидроксильной группы в молекулу стероида микробиологическим путем.
В 1949 году было выявлено эффективное антиревматическое свойство кортизона и ученые синтезировали ацетат кортизона из дезоксихолевой кислоты с выходом продукта всего 15%. Первоначально химический синтез кортизона включал 37 стадий, а стоимость 1г вещества: 200 долларов.
Но только в 1952 году, после получения 11-α-гидроксипрогестерона (авторы Петерсон и Меррей) из прогестерона культурой плесневого гриба Rhizopus nigricans уже с высоким выходом продукта, представилась возможность промышленного использования микроорганизмов в синтезе лекарственных средств стероидной структуры. В результате микробиологической трансформации синтез кортизола упал до 11 стадий, а стоимость 1г – 6 долл.
Основоположник биотрансформации стероиов в российской науке: Скрябин. В конце 60-х – начале 70-х годов были разработаны и внедрены в производство технологии получения преднизона и преднизолона, впервые в СССР было освоено промышленное производство стероидных препаратов на основе микробиологической трансформации.
Использование мутантных штаммов позволило к 2002 г снизить цену кортизола в США до 0,3 долл. за 1 г, т.е. в 600 раз меньше по сравнению с чисто химическим синтезом.
Проведение биотрансформации стероидов
Это аэробный процесс глубинной ферментации, для проведения которой используется оборудование, отвечающее высокой степени массообмена.
Чтобы провести трансформацию какого-либо вещества, вначале размножают культуру соответствующего микроорганизма до количества, равного 5-10% объема трансформируемого раствора.
Раствор для трансформации вещества готовят, учитывая, что в нем надо растворить максимально возможное количество трансформируемого вещества (обычно 10-25%) и надо использовать минимальное количество необходимых для развития культуры питательных веществ, в таком виде, чтобы не было затруднено химическое выделение вещества.
Если трансформируемое вещество не растворяется в воде, его предварительно растворяют в нейтральном органическом растворителе и затем, при интенсивном перемешивании, смешивают с основной средой.
При поисковых работах ограничиваются проведением реакции в колбах на качалках, загрузка стероида в колбу составляет 100—200 мг.
Для загрузок порядка 1—2 г стероида применяют стеклянные ферментеры.
В промышленности и на опытных установках применяют стальные аппараты, оборудованные аэрирующими и перемешивающими устройствами.
Обычно используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подавляет рост других микроорганизмов.
Трансформация может осуществляться
• растущей на среде культурой,
• отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. Это предпочтительнее – облегчает выделение и очистку целевого продукта. Но, как показала производственная практика, не все микроорганизмы переносят промышленное сепарирование без потери активности (мукоровые грибы очень чувствительны к сепарированию, а несовершенные грибы теряют свою активность незначительно).
Трансформация стеринов микроорганизмами основана на их использовании в качестве источника углерода, поэтому стимуляция роста трансформирующих штаммов должна приводить к увеличению выхода продуктов расщепления стеринов. Процесс стимулируется насыщением среды кислородом. Добавление в питательную среду некоторых