ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 29.10.2023
Просмотров: 135
Скачиваний: 1
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Фазы потенциа- ла действия: а – локальный ответ; б
– потенциал дейст- вия, которому пре- дшествует локаль- ный ответ; в – сле- довая гиперполя- ризация.
Стрелки – нане- сение стимулов
. По перечис- ленным выше свойствам ло- кальный ответ сходен с таки- ми явлениями как процесс местного нераспространяющегося возбуждения, а также с возбудитель- ным постсинаптическим потенциалом, возникающим на постсинаптической мемб- ране под влиянием деполяризующего действия возбуждающих медиаторов
1
14
Потенциал действия.
При нанесении достаточно сильных пороговых и сверх- пороговых импульсов тока деполяризация мембраны достигает некоторого критиче- ского (порогового) уровня и в реакциях аксона начинают проявляться существенные качественные изменения. Это электрической состояние мембраны называется
кри-
тическим уровнем деполяризации (
Е
кр
).
Критический уровень деполяризации у различчных клеток и волокон неодинаков. Он может колебаться от нескольких мВ до
30-50 мВ.
А упомянутые качественные изменения состоят в том, что мембрана клетки начи- нает стремительно изменять свой потен- циал и развивается явление, которое име- нуется
потенциалом действия
Фазы потенциала действия.
Потенци- ал действия имеет несколько фаз: при до- стижении критического уровня деполяри- зации потенциал клетки быстро нараста- ет в положительную область. Этот пери- од потенциала действия называется фазой деполяризации. Затем развиваются следо- вые процессы в виде
следовой деполяризации
либо
следовой гиперполяризации
Уже в первых опытах
А.Ходжкина
и
Э.Хаксли
был обнаружен, на первый взгляд, удивительный эффект. Во время генерации потенциала действия мембранный потен- циал уменьшался не просто до нуля, как следовало бы из уравнения Нернста, но из- менял свой знак на противоположный.
1
15
То есть процесс деполяризации на этом не заканчивается и позитивный заряд на мембране продолжает расти. Он преодолевает нулевое значение потенциала и достигает значений +35 мВ. После достижения пика величина потенциала вновь падает в отрицательную область, опять пересекает 0 мВ и достигает вели- чины мембранного потенциала (потенциала покоя). Эта период носит название фазы реполяризации. Превышение потенциала действия над нулевой линией на- зывается
овершутом
(превышение, перехлест).
П
ерезарядка мембраны, или овершут, весьма характерна для большинства возбудимых тканей. Амплитуда овершута характеризует состояние мембраны и зависит от состава вне- и внутриклеточной среды. На высоте овершута потен- циал действия приближается к
равновесному натриевому потенциалу,
поэ- тому происходит изменение знака заряда на мембране.
Для потенциала действия характерна последовательность событий, когда самоусиливающаяся деполяризация начинается с небольшого изменения мемб- ранного потенциала. Чтобы открылось достаточное для запуска этого процесса число натриевых каналов, начальное снижение мембранного потенциала долж- но деполяризовать мембрану до порогового уровня. Если этот порог достигнут, дальнейшее усиление деполяризующего стимула уже не будет влиять на макси- мальную величину сдвига мембранного потенциала: однажды запущенный про- цесс самопроизвольно идет до конца независимо от силы первоначального сти- мула. Эту реакцию именуют
законом «все или ничего»
и ее можно противопо- ставить плавному (градуальному) изменению потенциала при локальном ответе.
1
16
Распространение На 1-2 мм с затуханием Без декремента по всей длине
(с декрементом) нервного волокна
Зависимость от величины Возрастает с увеличением силы Не зависит (подчиняется закону стимула раздражения «все или ничего»)
Суммация Суммируется - возрастает при частых Не суммируется повторных подпороговых раздражениях
Амплитуда 10-40 мВ 90-130 мВ
Возбудимость при Увеличивается Уменьшается до абсолютной возникновении потенциала рефрактерности
Свойства Локальный потенциал Потенциал действия
Таблица 1.1
Свойства локального потенциала и потенциала действия
.
Локальный потенциал и потенциал действия
По своим свойствам они существенно отличаются. Это может свидетельствовать о том, что в их природе функционируют разные механизмы.
Потенциал действия является основой процесса распространяющегося возбуждения и ему присущи ряд свойств: первое – он возникает при действии пороговых и сверхпороговых раз- дражителей на фоне критического уровня деполяризации; второе – он имеет четкий порог возникновения и подчиняется закону «все или ничего»; третье – он распространяется от места возникновения в виде волны возбуждения, без затухания и с большой скоростью – до
140 м/с; четвертое – потенциалы действия не способны к суммации.
1
17
Возбудимость клетки во время
потенциала действия
Возбудимость клетки во время потенциала действия имеет фазовый характер, она быстро и сильно изменяется. Различают несколько фаз изменения возбудимости:
Кратковременное повышение возбудимости в начале потенциала действия. В зависимости от силы раздражителя может формироваться либо локальный потенциал, либо потенциал действия. Возбудимость по- вышается потому, что клетка частично деполяризована и потенциал покоя приближается к критическому значе- нию. Когда деполяризация достигает 50% от пороговой величины, начинают открываться быстрые потенциал – чувствительные Na
+
- каналы.
Фазовые изменения возбудимости клетки (Б): 1 – повышение возбуди- мости во время локального потенциала, 2 – абсолютная рефрактерная фаза, 3 – относительная рефрактерная фаза, 4 – фаза экзальтации во время потенциала действия (А)
Абсолютная рефрактерность
– это полная невозбу- димость клетки. Соответствует пику потенциала дейст- вия и продолжается 1-2 мс. Невозбудимость на фазе деполяризации и восходящей стадии инверсии обусловлена тем, что запущен каскад регенеративных реакций, на который повлиять извне уже нельзя: быстрые m-ворота Na
+
-каналов уже открыты, а еще закрытые открываются в ответ на уменьшение мембранного потенциала.
Б
А
1
18
В период нисходящей стадии инверсии мембрана невозбудима, так как закрываются инактивационные ворота, состояние которых не может изменить даже сильное раздражение.
Абсолютная рефрактерная фаза продолжается и в период реполяризации до достижения величины Е
кр
± 10 мВ.
Абсолютная реф-
рактерная фаза ограничивает максимальную частоту генерации потенциала действия. Если абсолютная рефрактерность завершается через 2 мс после начала потенциала действия, клетка может возбуждаться с частотой около 500 имп/с.
Нейроны ретикулярной формации и толстые миелиновые нервные волокна могут генерировать потенциалы действия с частотой до 1000 имп/с.
Относительная рефрактерная фаза
– период восстановления возбудимо- сти, когда сильное раздражение может вызвать новое возбуждение. Соответ- ствует конечной стадии реполяризации и следовой гиперполяризации. Понижен- ная возбудимость связана с повышенным транспортом иона К
+
из клетки. Поэ- тому для вызова возбуждения необходимо более сильное раздражение. Кроме того во время гиперполяризации потенциал больше и, следовательно, дальше от- стоит от
критического уровня деполяризации
. У нервных волокон
относите-
льная рефрактерность длится несколько мс.
Фаза экзальтации
– это период повышенной возбудимости. Он соответ- ствует следовой деполяризации. В нейронах центральной нервной системы возможна частичная деполяризация вслед за гиперполяризацией. Повышенная возбудимость обусловлена пониженным мембранным потенциалом и по- вышенной проницаемостью мембраны для ионов Na
+
1
19
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА
И ПОТЕНЦИАЛА ДЕЙСТВИЯ
Один внутриклеточный электрод
Измерение разности потенциалов
Электрические явления на клеточных мемб- ранах могут измеряться с помощью острых стеклянных микроэлектродов, которые вво- дятся в клетку. Техника с одним внутри- клеточным электродом позволяет измерять разность потенциалов при фиксированном токе. Реже при помощи этой техники можно измерить ток при фиксированном потенци- але при помощи методики коммутационной фиксации потенциала. Все измерения про- исходят исключительно на целой клетке, таким образом изучаются электрические свойства всей клеточной мембраны.
1
20
Двухэлектродная фиксация потенциала
Тот факт, что фиксация трансмембранного потенциала позволит измерять мембранную проводимость по изменениям тока при постоянном напряжении, был впервые осознан еще в 40-х гг. XX века, и вскоре
Алан Ходжкин
и
Эндрю Хаксли начали эксперименты с двух-электродной фиксацией потенциала (
2-electrode voltage clamp
). Суть метода состоит в следующем. В клетку вводятся два электрода, еще один – индифферентный электрод – остается вне клетки. Первый внутриклеточный электрод служит для измерения трансмембранной разности потенциалов (то есть разности потенциалов между ним и индифферентным электродом), второй может подавать ток
. Генератор
сигнала подает
потенциал
, который равен трансмембранной разности потенциалов.
Измеренный трансмембранный потенциал подается на вход
устройства сравнения
, которое вычитает измеренный потенциал из поданного и, в зависимости от величины разности, подает ток на электрод так, чтобы скомпенсировать эту разницу. При этом постоянно измеряется величина тока, которая для этого необходима.
В 40-х–50-х годах XX века, когда работали
А.Ходжкин
и
Э.Хаксли
, не существовало
микроэлектродов
, поэтому в качестве внутриклеточных электродов использовались
макроэлектроды
– тонкие проволочки. Это определило выбор объекта – гигантский аксон кальмара диаметром 1 мм, внутрь которого и вводились
макроэлектроды
. На этом объекте методом двухэлектродной фиксации потенциала исследователи выполнили эксперименты, в которых была установлена ионная природа потенциала действия и впервые постулировано существование ионных каналов.
1
21
Метод локальной фиксации потенциала
О методе
path-clamp
все узнали после того как
Эрвин Негер
и
Берт Сакман
в 1976 году описали его в журнале «
Nature
». Основой для создания метода послужило обна- ружение факта, что при определенных условиях клеточная мембрана формирует
пло-
тный контакт
с поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода. При неболь- шом разрежении, создаваемом внутри пипетки, между стеклом и мембранным фрагме- нтом возникает контакт, имеющий
гигаомное
сопротивление.
. Наиболее близким к естественным условиям является вариант измерения ионных токов на прикрепленной, но неповрежденной (
cell-attached
) клет-
ке, поскольку исследуемый участок мембраны не отделяется от клетки и не нарушается его связь с цитоплаз- мой. Измерение на целой клетке при разрушении мембраны в кончике ми- кропипетки (
whole-cell
) позволяет за- менять ионный состав цитоплазмы и изучать на диализированных таким образом клетках ионные токи в ре- жиме фиксации напряжения.
варианты метода path-clamp
(расположение объекта по отношению к
кончику микропипетки)
outside-out
(внутри)
whole-cell (целая)
attached-cell (прикрепленная)
inside-out
(наизнанку)
1
22
Особенности м
етода
мкм могут образовывать контакты с кле- точной мембраной (на границе «мембрана – стекло») с сопротивлением в несколько гигаом – это так называемый гигаомный контакт. Он позво- ляет изолировать от внешней среды и от остальной части мембраны тот ее фрагмент, который находится внутри пипетки.
Отграниченный пипеткой фрагмент мембраны и называется
patch
–
«фрагмент, заплатка», слово
clamp
«фиксация» в названии метода можно интерпретировать и как захват и изоляцию этого фрагмента, так и как фиксацию трансмембранного потенциала в изолированном фрагменте, или потенциала либо тока на целой клетке. В пипетку, заполненную раствором электролита, помещается
хлор-серебряный
электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости.
Фотомикрография кончика пипетк и
Исследования пошли полным ходом, ког- да оказалось, что конусообразные стекля- нные пипетки с диаметром кончика 1-2 1
23
Обонятельная цилиарная клетка удерживается стеклянной микропипеткой (сверху на фотографии), и к ней подводят стеклянный микроэлектрод (внизу справа). Клеточная мембрана формирует очень плотный контакт с поверхностью кончика микроэлектрода.
Метод локальной фиксации потенциала или
patch-clamp
дает возможность контролировать разность потенциалов между сторонами мемб- раны, а также помещать ее в среду с определен- ным химическим составом. В этих хорошо кон- тролируемых условиях измеряют ионные токи, проходящие через
мембрану
, что, в конечном итоге, позволяет делать выводы о том, как ион- ные каналы реагируют на электрическое и хи- мическое воздействие.
Метод настолько чувствителен, что позволяет наблюдать поведение и химические превраще- ния
единичных молекул, взаимодействующих
с мембраной
. Разработаны экспериментальные подходы, позволяющие измерять характеристики ионных каналов оптимальным образом.
Немецкие исследователи –
Э.Негер
и
Б.Сакман
, – разработавшие эту методику, получили Нобелевскую премию в 1991 году.
1
24
Конфигурация inside-out
Eсли пипетку быстрым движением отвести от клетки, например, ооцита лягушки, то «внутренний» кусочек мембраны оторвется от клетки и получится конфигурация
inside-out
(
наизнанку
– наружная сторона внутри), названная так потому, что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны окажется снаружи – в омывающем растворе, а наружная – внутри пипетки. ток интересующие нас каналы. В этом случае мы точно знаем как состав жидкости по обе стороны мембраны, так и разности потенциалов, что позволяет доста-точно точно характеризовать каналы, используя уравнение
Нернста. Следует иметь ввиду – если в изолированный участок мембраны попал один канал, то мы наблюдаем поведение единичной молекулы.
Принципиальная схема
patch-clamp
в конфигура- ции
inside-out.
Наружную поверхность пипетки покрывают силгардовой резиной. Особенностью незастывшего силгарда является его способность растекаться тонкой пленкой по поверхности сте- стекла на несколько миллиметров, покрывая при этом и кончик микроэлектрода.
При этом, можно изучать, как влияют на
1
25