Файл: Мембранология и электрогенез.pdf

Примеры записей, получаемых
методом patch-clamp
Запись одиночного канала рецептора глицина. Четко видны два состояния:
закрытое
(ему соответствует нулевой ток) и
открытое
(ему соответствует ток примерно в 7 пикоампер). Канал время от времени спонтанно переходит из одного состояния в другое, промежуточных состояний нет.
Запись тока одиночного канала
(глицинового рецептора). Вверху данные, получаемые непосредстве- нно в опыте; внизу - те же данные после фильтрации электрического шума.
Запись позволяет получить две важнейшие характеристики канала:
проводимость
(исходя из величин трансмембранной разности потенциалов и тока) и вероятность нахождения в
открытом состоянии
(определяемое как отношение времени, когда канал открыт к времени, когда он закрыт). К слову, чаще всего активность канала физиологически регулируется путем изменения этой вероятности.
1
26

Зависимость событий (числа открытия каналов) и
электропроводности мембраны (γ) от амплитуды тока (I) и
времени (длительности) открытия (τₒ) канала
Метод локальной фиксации потенциала кле- точной мембраны позволяет изолировать фра- гмент клеточной мембраны, задавать опреде- ленную разность потенциалов через этот фра- гмент, создавать по обе стороны мембраны среду с определенным ионным составом и измерять при этих, хорошо контролируемых условиях, электрический ток, проходящий через каналы.
Гигантская аналитическая мощность метода заключается в том, что он позволяет наблю- дать за поведением и химическими превраще- ниями отдельных молекул. Модификации ме- тода позволяют изменять разнообразные – а, в целом, практически все интересующие нас фа- кторы, которые способны влиять на поведение ионных каналов.
Таким образом у исследователей появидась возможность определить многие свойства ме- мбраны клетки и устройство ионных каналов
1
27

. Введение
амилорида
всякий раз приводит к падению тока до нуля, из чего следует, что практически вся проводимость при −60 мВ в данной клетке – это проводимость эпителиального натриевого канала. Кстати, чувствительность к ингибиторам – это еще одна из важнейших характеристик канала
В противоположность предыдущей записи, изменения тока выглядят непрерывными – это связано с тем, что одновременно записывается много каналов (около 2000), соответственно, имеется примерно 2000 уровней тока – от «все открыты» до «все закрыты».
Клетка эпителия собирательной трубки
Трансмембранный потенциал −60 мВ (верх записи). С интервалами в 1 минуту на
30 секунд в омывающий раствор вводится
амилорид
– ингибитор эпителиального натриевого канала (время введения показано темными прямоугольниками, а темными полосками – тестовый имульс).
Запись амилорид-чувствительного
тока в главной клетке собиратель- ной трубки почки методом целой клетки
(whole-cell). Кончик пипетки только подведен к клетке и мембрана ее цела.
1
28

Возможности метода
Метод
patch-clamp
дает неограниченные возможности для иccледования уст- ройства и функций каналов различных
мембран
, вплоть до микроскопических органоидов клетки –
митохондрий
и
рибосом
Поведение одиночного ми- тохондриального (сверху) и протеолипосомного (снизу) каналов. А – фазово-контра- стные картины формирова- ния взаимодействия микро- пипетки и клеточных оргаганоидов. В – типич- ные записи электрической активности одиночного ка- нала митохондрии (сверху) и протеолипосомы (внизу).
С – блокада ионного тока введением 50 μМ дибукаи- на. D,E – влияние цитох- рома с (cyt c) на поведение канала, на который не действует введение гемо- глобина (Hb).
1
29

Методы исследования структуры
мембранных белков
Изучение структуры ионных каналов, формирующих
мембранный потен-
циал или потециал покоя,
осуществляется с помощью различных методов, включая совре-менные резонансные –
ЯМР, ЭПР
. К ним относятся:
–
фазово-контрастной микроскопии.
Метод основан на разных показателях пре- ломления неоднородной структуры белко- вой молекулы);
–
электронной микроскопии
(метод име- имеет преимущества, благодаря высокой разрешающей способности метода);
– наиболее мощной технологией изуче- ния белков клеточной мембраны является
рентгеновская кристаллография
. Суть метода такова: выращивается кристалл из изучаемого белка или другой биомолекулы, а затем он облучается рентгено- вскими лучами. Анализируя картину рассеивания лучей на объекте, мож- но восстановить его структуру.
1

–
рентгеноструктурного анализа
(благодаря дифракции рентге- новских лучей создаются условия для построения пространствен- ного расположения молекул белка);
– моделирования
. Метод широко используется для изучения стру- ктуры белков мембраны.
Он позволяет предс- тавить пространственно структуру белковых мо- лекул, входящих в мемб- ранные рецепторы.
Модель
АТФ-азы
(верхний фра- ф гмент). Следует обратить внима- ние, что сверху изображена внут- тренняя среда клетки. На нижнем фрагменте рисунка показана кри- сталлическая реконструкция
ме-
бранной АТФ
-
азы.
1
31

СВОЙСТВА МЕМБРАННОГО
ПОТЕНЦИАЛА

Электрические свойства мембраны клетки
Рассмотрим свойства клеточной мембраны более обстоятельно
. Известно, что в невозбужденном состоянии клеточная мембрана высокопроницаема для ионов калия и малопроницаема для ионов натрия. Это было показано в опытах с использованием изотопов натрия и калия: спустя некоторое время после введения внутрь аксона радиоактивного калия его обнаруживали во внешней среде. Таким образом, происходит пассивный (по градиенту концентраций) выход ионов калия из аксона. Добавление радиоактивного натрия во внешнюю среду приводило к незначительному повышению его концентрации внутри аксона. Пассивный вход натрия внутрь аксона несколько уменьшает величину потенциала покоя.
Трансмембранная диффузионная разность потенциалов
рассчитывается по формуле Нернста:
RT а
1
E= ----- ln ----- ; (1.3)
nF а
2
где Е – диффузионный потенциал, R – газовая постоянная, Т – абсолютная температура, n – валентность нона, F – постоянная Фарадея, а
1
– активность – ионов в области, откуда идет диффузия, а
2
– активность ионов в области куда идет диффузия.
Установлено, что имеется разность концентраций
ионов калия
вне и внутри клетки, причем внутри клетки ионов К
+
примерно в
20-50 раз больше
, чем вне клетки. Известно, что если два раствора с различными концентрациями ионов разделены проницаемой для ионов мембраной, то ионы будут перемещаться по своему концентрационному градиенту. Транспорт ионов приводит к возникновению на мембране градиента потенциала. Возникшая разность потенциалов оказывает влияние на транспорт ионов.
1
32

Таблица 1.2
Внутриклеточные и внеклеточные концентрации ион
ов
(
в мышечных клетках гомойотермных животных при потенциале покоя = –90 мВ. А
–
– высокомолекулярные клеточные анионы).
Na
+
12 ммоль л
–1
Na
+
145 ммоль л
–1
К
+
155 ммоль л
–1
К
+
4 ммоль л
–1
Сa
2+
10
–8
-10
– 7
ммоль л
–1
Сa
2+
2 ммоль л
–1
Cl
–
4 ммоль л
–1
Cl
–
120 ммоль л
–1
HCO
3
–
8 ммоль л
–1
HCO
3
–
27 ммоль л
–1
A
–
155 ммоль л
–1
Проч.катионы 5 ммоль л
–1
внутриклеточная концентрация внеклеточная концентрация
Отношение концентраций двух ионов Na
+
и K
+
внутри и снаружи составляет:
Na
+
внутри / Na
+
снаружи = 0.12 < внутри меньше в 12 раз,
К
+ внутри / К
+ снаружи = 38.0 > внутри больше в 38 раз.
1
33

NB!
Разность
концентраций
ионов К
+
вне и внутри клетки и высокая
проница-
емость
клеточной мембраны для этих ионов, обеспечивают их диффузионный ток
из клетки наружу и накопление избытка положительных ионов К
+
на наружной
стороне клеточной мембраны
. Это противодействует дальнейшему выходу ионов
К
+
из клетки. Диффузионный ток ионов К
+ существует до тех пор, пока стремление их двигаться по концентрационному градиенту не уравновесится разностью потенциалов на мембране, тогда ионный ток
прекращается.
Эта разность потенциалов называется
потенциалом равновесия для калия
или
равновесным потенциалом
.
Величина
равновесного потенциала
также рассчитывается по формуле Нернста:
RT [К
+
]out
Ek = ----- ln -------- ; (1.4)
nF [К
+
]in
где Еk – равновесный потенциал, R – газовая постоянная, Т – абсолютная температура, n – валентность нона, F – постоянная Фарадея, Коut и Kin – концентрации ионов К
+
вне и внутри клетки соответственно.
Важно подчеркнуть следующие два момента:
во-первых
, состояние равновесия нас- тупает в результате диффузии лишь очень небольшого количества ионов (по сравнению с их общим содержанием);
во-вторых,
калиевый равновесный потенциал всегда боль- ше (по абсолютному значению) реального потенциала покоя, поскольку мембрана в по- кое не является идеальным изолятором, в частности имеется небольшая утечка ионов
Na
+
. Сопоставление теоретических расчетов показали хорошее совпадение с экспе- риментальными данными.
1
34

Если искусственно изменить потенциал покоя, то при его восстановлении ток ионов (даже при достижении потенциалом покоя исходного уровня) не
ос-
танавливается
, так как имеются постоянно открытые каналы и
К
+
продол- жает перемещаться сквозь мембрану. Однако число ионов, которые вошли в клетку и вышли из нее, теперь оказывается одинаковым. Такое состояние назы- вается
динамическим равновесием.
Если интенсивность одного из процессов изменится, то точка равновесия сместится: при ис- кусственном
повышении
конце- нтрации К
+
в межклеточной сре- де
диффузия снижается
Часть ионов будет втянута внутрь клетки, и потенциал по- коя сместится вверх. При
умень-
шении
содержания ионов калия в межклеточной среде
диффузия
усиливается
, и потенциал покоя сместится вниз
Роль ионов
К
+
в возникновении и поддержании потенциала покоя: а – возникновение потенциала покоя вследствие диффузии ионов
К
+
через постоя- нно открытые калиевые каналы; б – изменение уровня потенциала покоя при удалении
К
+
из меж- клеточной среды или добавлении
К
+
в межклеточ- ную среду: 1 – удаление
К
+
(
рост диффузии
); 2 – добавление
К
+
(
снижение диффузии
).
1
35

Равновесные потенциалы
Мы уже несколько раз упоминали такое понятие, как
равновесный потенциал
Формирование равновесного потенциала для определенного иона происходит сле- дующим образом. Для примера рассмотрим формирование потенциала равновесия для иона К
+
. Ионы К
+
во внутренней среде клетки присутствуют в большей концен- трации, чем снаружи и поэтому они стремятся путем диффузии перейти в область с более низкой концентрацией, то есть выйти наружу по градиенту концентрации. В результате на внешней поверхности мембраны будет накапливаться положительные заряды. Электрические силы положительных зарядов, скопившиеся на наружной по- верхности мембраны клетки, по мере выхода иона К
+
, противодействуют силам кон- центрационного градиента и препятствуют дальнейшему выходу иона К
+
. В опреде- ленный момент, то есть при определенном мембранном потенциале электрические силы, определяемые зарядами на мембране, будут равны противоположно направлен- ленным химическим силам, обусловленным градиентом концентрации и движение ионов К
+ прекращается. Такой потенциал на мембране называется
потенциалом ра-
вновесия для калия или равновесным потенциалом
NB!
Равновесный потенциал
(для соответствующего иона, Еk) – это разность потенциалов между внутренней
средой клетки и внеклеточной жидкостью, при которой вход и выход иона
уравновешен, то есть тогда, когда химическая разность потенциалов равна эле-
ктрической
Так формируются потенциалы равновесия для всех ионов, и не только К
+
, но и
Na
+
, Cl
-
, Са
2+
1
36