ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.11.2023
Просмотров: 19
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
-
Репликация ДНК
Генетическая программа клеточных организмов записана в нуклеотидной последовательности ДНК. Для сохранения уникальных свойств организма необходимо точное воспроизведение этой последовательности в каждом последующем поколении. Во время деления клетки содержание ДНК должно удвоиться, чтобы каждая дочерняя клетка могла получить полный спектр ДНК. Так, кишечная палочка при образовании каждого последующего поколения должна дуплицировать практически без ошибок полный геном размером 4- 10*’ н.п., точно так же должны быть скопированы почти 6 млрд н.п. в любой соматической клетке человека. Процесс удвоения родительских молекул геномной ДНК во время воспроизводства клеток живого организма получил название репликации, или репликативного синтеза ДНК. Репликация ДНК является примером матричного синтеза биологических макромолекул. Основу хромосомы составляет одна непрерывная двуцепочечная молекула ДНК. Во время репликации каждая из цепей родительской ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи. Положение каждого нуклеотида в строящейся цепи ДНК по правилам комплементарности (G—С и А—Т) однозначно определяется положением соответствующего нуклеотида матрицы. Механизм происходящей при репликации ДНК химической реакции заключается в переносе остатка дезоксирибонуклеозидмонофосфата от дезоксирибонуклеозидтрифосфата на концевой нуклеотидный остаток растущей в процессе синтеза нуклеотидной цепи (рис. 104). Перенос идет на место атома Н гидроксильной группы, стоящей при 3-м углеродном атоме дезоксирибозы концевого нуклеотида, и сопровождается выделением пирофосфата, который затем расщепляется неорганической пирофосфатазой, что делает реакцию полимеризации практически необратимой. Так как формирование нового полинуклеотида идет на полинуклеотидной матрице при непрерывном замыкании водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями матрицы и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, то условием функционирования этого механизма является одноцепочечная структура матрицы. В связи с этим существенным моментом в биосинтезе является расхождение биспирального полидезоксирибонуклеотида на одиночные полидсзоксирибонуклеотидные цепи
, на которых осуществляется сборка комплементарных им полинуклеотидов. В итоге из одной биспиральной молекулы ДНК образуются две биспиральныс молекулы ДНК, совершенно идентичные друг другу и исходной молекуле ДНК. После одного раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних молекул является родительской, т.е. консервативной, а другая — синтезированной заново. Такой способ удвоения молекул ДНК называется палуконсервативным. В 1958 г. М.Мезельсон и Ф. Сталь получили экспериментальное доказательство полуконсервативного способа репликации ДНК.
-
Вещества участвующие в репликации ДНК
Процесс репликации ДНК осуществляется с участием множества белков, которые образуют сложный и эффективно работающий репликативный комплекс.
ДНК-полимеразы. Комплементарное копирование одноцепочечной матрицы катализируют ДНК-зависимые или просто ДНК-полимеразы. Некоторые про- и эукариотические ДНКполимеразы получены в чистом виде, охарактеризованы их физические и ферментативные свойства. И хотя эти свойства не совсем идентичны, механизм их катализа для всех указанных ферментов в общих чертах одинаков. Полимеризация нуклеотидов в процессе репликации происходит только в одном направлении: от 5'-конца к З'-концу (5'-»3') строящейся цени, и синтезированная полинуклеотидная цепьДНК антипараллельна по отношению к ДНК-матрице (рис. 104). ДНК-полимеразы безразличны к последовательности нуклеотидов матрицы. ДНК синтезируется чрезвычайно быстро: скорость ее полимеризации колеблется в пределах от 50 нуклеотидов/с у эукариот до 500 нуклеотидов/с у бактерий. Нормальное размножение клеток требует высокой точности копирования ДНК-матрицы, для чего существуют специальные механизмы, один из которых — механизм коррекции. ДНК-полимеразы проверяют комплементарное™ каждого нуклеотида матрицы дважды: один раз — перед включением его в состав растущей цепи и второй раз — перед тем, как включить следующий нуклеотид.
ДНК-праймаза. ДНК-полимеразы не способны инициировать синтез новых цепей ДНК, они могутлишьдобавлятьдезоксирибонуклсотидные звенья к З'-конну уже имеющейся полинуклеотидной цепи. Чтобы молекулы ДНК-полимераз могли начать синтез ДНК, им необходима затравка, или праймер (от англ, primer— затравка), короткий олигодезоксирибонуклеотид или олигорибонуклеотид, комплементарный соответствующему участку ДНКматрицы, у которого на конце имеется свободная З'-ОН-группа. Неспособность молекул ДНК-полимераз самостоятельно, без затравки начинать синтез ДНК принципиально отличает эти ферменты от других ферментов матричного синтеза — РНК-полимераз. На сталии инициации репликации короткую РНК-затравку из рибонуклеозидтрифосфатов синтезирует фермент, называемый ДНК-праймазой. ДНК-праймаза может быть отдельным ферментом (как у бактерий) или входить в качестве субъединицы в ДНКполимеразу (как у ДНК-полимеразы а эукариот). В любом случае праймаза — это фермент, отличный от РНК-полимераз, которые синтезируют разнообразные клеточные РНК. После
того как будет синтезирован РНК-праймер, подключается ДНК-полимераза и продолжает наращивать цепь. Новосинтезированныс цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов: у прокариот — от двух до пяти нуклеотидов, у эукариот их в два раза больше. В дальнейшем короткие праймеры замешаются сегментами ДНК.
и ДНК. Поскольку две цепи в молекуле ДНК антипараллельны, а ДНКполимеразы способны наращивать полинуклеотидную цепь только в направлении 5'—*3', один и тот же фермент, ДНК-полимераза, не может обеспечить сборку дочерних цепей одновременно в направлениях 5'->3' и 3'->5' в соответствии с перемещением репликативной вилки при расплетании биспиральной молекулы ДНК. Направление расплетания двойной спирали при репликации совпадает с направлением синтеза ДНК лишь для одной матричной цепи, в то же время оно противоположно направлению синтеза ДНК на комплементарной матрице.
ДНК-лигаза. ДНК-лигазы вирусов, бактерий, млекопитающих соединяют 5'-фосфатную и З'-гидроксильную группы нуклеотидов, находящихся на противоположных концах одноцепочечного разрыва в дуплексе ДНК. В результате образуется фосфодиэфирная связь, ликвидирующая этот разрыв (рис. 106). ДНК-лигаза Е. coli — это одиночный полипептид (мол. масса 75 000 Да). Для образования фосфодиэфирной связи между концами нуклеотидных пеней ДНК-лигазы используют энергию гидролиза АТР , либо NAD. Реакция протекает в три стадии:
-
Реакции аденилирования ДНК-лигазы. Фермент взаимодействует с АТР (ДНК-лигаза фагов и млекопитающих) или NAD (ДНКлигаза Е. coli) с образованием фермента — аденилатного произ водного по c-NHi-группе остатка лизина полипептидной цепи с одновременным высвобождением пирофосфата (в случае АТР) или никотинамидмононуклеотида (в случае NAD). -
Реакция трансаденилирования. Остаток гиен иловой кислоты с аденилатлигазы перебрасывается на свободную фосфатную группу 5'-углеродного атома рибозы концевого нуклеотида. -
III. Реакция лигирования. Между сближенными активированной аденилатом 5'-фосфатной группой и З'-ОН-группой фрагмента цепи ДНК происходит образование фосфодиэфирной связи с выделением АМР.
ДНК-хеликаза. Нативные ДНК биспиральны. Для осуществления комплементарного копирования цепей двуцепочечная ДНК должна постепенно раскручиваться. Раскручивание, или расплетание, спирали происходит только в локальном участке ДНК. Эту реакцию осуществляет хеликаза — ДНК-зависимая АТРаза. ис- • пользующая энергию пиролиза АТР для расплетания двойной спирали ДНК. Хеликазы имеют кольцевую (тороидальную) структуру, образованную шестью субъединицами. Такие гексамерные хеликазы кольцеобразной формы обнаружены у фагов, вирусов, бактерий, архей, эукариот (рис. 107). Наружный диаметр хеликазного кольца варьируют от 12 до 14 нм. внутренний диаметр — от 2 до 4 нм. достаточный для взаимодействия как с одноцепочечной, так и с двуцепочечной ДНК
-
Начало репликации
Молекула ДНК, способная к автономной репликации, получила название репликона. Репликон содержит все необходимые гены и регуляторные последовательности, которые обеспечивают регулируемое удвоение его ДНК. Участок репликона, в котором начинается репликация, называется репликатором, или областью начала репликации (англ, replication origin), у Е. coli — ori С. При инициации репликации инициатор, кодируемый репликоном (у Е. coli — белок Dna А), взаимодействуете репликатором. Целая хромосома Е. coli является репликоном; у эукариот репликоном называют отрезок ДНК, репликация которого протекает пол контролем единственной точки начала репликации. Точка начала репликации имеет специфическую последовательность основании, богатую парами А—Т, что, вероятно, облегчает разделение цепей. В результате инициации раунда репликации в точке ori образуется одна или две репликативные вилки. При однонаправленной репликации возникает одна репликативная вилка (плазмида ColFI), и синтез заканчивается в точке ori (рис. 108). При двунаправленной репликации (хромосома Е. coli) инициируются две репликативные вилки, перемещающиеся в противоположных направлениях до тех пор, пока они не встретятся на противоположной стороне кольца.