Файл: Общая характеристика группы веществ, изолируемых из биологического материала настаиванием с полярными растворителями.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.11.2023
Просмотров: 280
Скачиваний: 5
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
1. Предварительная обработка биопробы
- удаление фоновых веществ (обезжиривание,измельчение)5
- концентрирование определяемых веществ
2. Измерение рН.
3. Экстракция органическим растворителем.
4. Концентрирующая реэкстракция.
5. Идентификация.
6. Обработка результатов анализа.
Вторым этапом после изолирования является качественное определение токсиканта химическими реакциями или физико-химическими методами. При ХТА предварительным испытаниям могут быть подвергнуты жидкости и порошки неизвестного состава, таблетки неизвестных лекарственных средств, объекты растительного происхождения, ткани и жидкости человека
Обнаружение барбитуратов
Для обнаружения барбитуратов применяются цветные реакции, реакции осаждения, микрокристаллоскопические реакции, методы хроматографии, УФ- и ИК-спектроскопии и др.
Предварительная проба. Для обнаружения барбитуратов в моче применяют предварительную пробу, основанную на реакции этих веществ с ацетатом кобальта и гидроксидом лития.
В делительную воронку вносят 50 мл мочи, к которой по каплям прибавляют 10 %-й раствор серной кислоты до рН = 4...5 и 50 мл диэтилового эфира. Содержимое делительной воронки взбалтывают. После разделения фаз отделяют эфирную вытяжку. Водную фазу еще раз взбалтывают с 50 мл диэтилового эфира.
Эфирные вытяжки соединяют и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл хлороформа. К хлороформному раствору прибавляют 2 капли свежеприготовленного 1 %-го раствора ацетата кобальта в метиловом спирте и несколько капель свежеприготовленного 1 %-го раствора гидроксида лития в метиловом спирте. После прибавления каждой капли указанных реактивов жидкость взбалтывают. Появление голубой окраски указывает на наличие барбитуратов в моче.
Изолирование по методу А.А. Васильевой водой, подкисленной щавелевой кислотой
В коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала,прибавляют двойное количество дистиллированной воды. Содержимое колбы хорошо перемешивают и подкисляют 5-10% водным раствором щавелевой кислоты до рН=2,5 (по универсальному индикатору). Смесь оставляют на2 ч при периодическом помешивании содержимого колбы. Затем с твердых частичек объектов сливают кислые водные вытяжки и процеживают их через марлю или небольшой ватный тампон. Твердые частички исследуемых объектов промывают водой (15-20 мл). Промывные воды присоединяют к кис лым водным вытяжкам.
Эти вытяжки переносят в делительные воронки и взбалтывают с тремя пор циями хлороформа (15, 10 и 10 мл). Хлороформные вытяжки соединяют и фильтруют через небольшой фильтр (диаметр 5-6 см), редварительно смо ченный хлороформом. Фильтраты собирают в сухие колбы. Полученные та ким образом хлороформные вытяжки исследуют на наличие веществ, экстра ирующихся хлороформом из кислых водных растворов.
Оставшиеся в делительных воронках кислые водные вытяжки, из которых хлороформом предварительно экстрагированы примеси и некоторые токси кологически важные вещества, подщелачивают 25% раствором гидроксида аммония до рН=8,5-9,0 и взбалтывают с тремя порциями хлороформа (15, 10 и 10 мл). Хлороформные вытяжки соединяют, фильтруют через бумажный фильтр, смоченный хлороформом, и исследуют на наличие токсикологическиважных веществ, экстрагирующихся из щелочной среды.
Частные методы
Изолирование производных барбитуровой кислоты по методу В.И. Поповой водой, подкисленной серной кислотой
В стакан органа трупа, прибавляют 80 мл 0,02 н. раствора серной кислоты, перемешивают и измеряют рН. При необходимости рН смеси доводят до 2-3 (по универсальному индикатору) 30% растворо серной кислоты, настаивают в течение двух часов при частом перемешива нии стеклянной палочкой. Через 2 часа вытяжку сливают, а биологический материал еще дважды заливают новыми порциями 0,02 н. раствора сернойкислоты (по 80 мл) и каждый раз смесь доводят до рН=2-3, а затем настаива
ют по одному часу.
Очистка вытяжек. Вытяжки объединяют, процеживают через сложенную в 3слоя марлю и центрифугируют в течение 25-30 минут (13-15 тыс. об/мин).Центрифугированную вытяжку очищают методом гель-хроматографии. Закрепленную в штативе колонку на одну треть заполняют 0,02 н. раствором серной кислоты и вносят суспензию ранее приготовленного геля Сефадекса G—25 (50 г с размером частиц 100-300 мкм заливают 0,02 н. раствором серной кислоты на 3 часа). После того, как в колонке осядет слой геля высотой 40 см, поверх геля помещают кружок фильтровальной бумаги. В колонке над гелем обязательно должен быть небольшой слой 0,02 н. раствора серной кислоты, который служит для защиты геля от попадания воздуха и высыхания. Во избежание перегрузки колонок с гелем большими объемами вытяжек, очистку 200 мл вытяжки производят в 4 приема (по 50 мл каждый прием). В колонку вносят 50 мл вытяжки и затем 2 раза по 2 мл 0,02 н. раствора серной кислоты (обеспечивает полное впитывание вытяжки гелем).
Элюирование производных барбитуровой кислоты. Колонку соединяют с сосудом, установленным выше нее и заполненным 0,02 н. раствором серной кислоты. Первые 150 мл элюата отбрасывают (в них содержатся примеси), а последующие 200 мл элюата собирают в стакан и переносят в делительную воронку емкостью 1000 мл. Затем таким же образом на той же колонке геля " очищают следующие 50 мл вытяжки и 200 мл элюата переносят в ту же делительную воронку. Из объединенного элюата (400 мл) барбитураты 3 раза экстрагируют хлороформом по 50 мл в течение 7-10 минут. В случае образования эмульсии, ее разрушают центрифугированием. Для освобождения хлороформной вытяжки от влаги в нее вносят 5-7 г безводного сульфата натрия и взбалтывают в течение 2-3 минут. Затем хлороформную вытяжку сливают с сульфата натрия в другой стакан, сульфат натрия промывают небольшим количеством хлороформа и этот хлороформ прибавляют к основной хлороформной вытяжке. Хлороформную вытяжку выпаривают досуха.
■ При исследовании гнилостно-разложившегося биологического материала проводят дополнительную очистку хлороформных вытяжек. Для этого хлороформные вытяжки 2 раза взбалтывают в течение 5-7 минут с 0,1% раствором едкого натра (по 25 мл). Затем водную вытяжку подкисляют 30% раствором серной кислоты до рН=2-3. Производные барбитуровой кислоты трижды экстрагируют хлороформом по 30 мл в течение 7-10 минут. Хлороформные извлечения объединяют, взбалтывают сддуль.,фатом,нахр.йЯ,. а затем выпаривают досуха. В сухом остатке проводят качественный анализ на наличие производных барбитуровой кислоты.
Изолирование производных барбитуровой кислоты по методу P. Valov водой, подщелоченной гидроксидом натрия
Тщательно измельчают 100 г исследуемого органа и смешивают со 180 мл дистиллированной воды и 20 мл 10% раствора едкого натра. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 минут в химическом стакане, затем центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин.
В центрифугат при постоянном перемешивании постепенно вводят 120 мл 10% раствора вольфрамата натрия и не менее 100 мл 1 н. раствора серной кислоты до рН=2. Стакан помещают на 20 мин на кипящую водяную баню и центрифугируют в течение 30 мин
Центрифугах сливают через ватный тампон, смоченный водой, в делительную воронку, тампон промывают 10 мл дистиллированной воды, и объединенные водные извлечения ркстрагирщот^равным объемом эфира в течение 15 мин.
Затем барбитураты реэкстрагируют 50 мл 10% раствора едкого натра. Щелочной раствор подкисляют 25% раствором серной кислоты до рН=2 и барбитураты вновь реэкстрагируют равным объемом эфира. Эфирное извлечение фильтруют в мерную колбу емкостью 50 мл. Объем доводят до метки эфиром. В объединенном извлечении проводят обнаружение производных барбитуровой кислоты.
Изолирование производных фенотиазина по методу Е.М. Саломатина спиртом, подкисленным щавелевой кислотой
100 г мелкоизмельченного органа обрабатывают последовательно тремя порциями этанола, подкисленного до рН=2-3 (по универсальному индикаторуили по рН-метру) 10% спиртовым раствором щавелевой кислоты.
Спиртовые извлечения отделяют декантацией, объединяют и выпаривают наводяной бане при температуре 60°С (при специальном задании исследованияна аминазин, а также на другие производные фенотиазина) до густоты сиропа. Операцию осаждения сопутствующих веществ абсолютным или 96° эти
ловым спиртом проводят 2-3 раза. Спиртовое извлечение выпаривают досухаили до густой консистенции. Остаток обрабатывают 80-100 мл теплой(40-60°С) дистиллированной воды и, после охлаждения до комнатной температуры, количественно отфильтровывают в делительную воронку.
Для десорбции аминазина и его метаболитов, частично сорбированныхфильтровальной бумагой, фильтр обрабатывают 10-20 мл воды, подкисленной 5% раствором щавелевой кислоты до рН=2-3, и производят двукратнуюэкстракцию эфиром порциями по 50 мл. Кислую эфирную фракцию обезво
живают и в случае необходимости исследуют на наличие производных барбитуровой кислоты и отдельных алкалоидов.
Кислое водное извлечение подщелачивают 50% раствором едкого натра дорН=13 и экстрагируют 3-4 порциями эфира (по 1/3 от объема водной фазы).Эфирные извлечения отделяют, объединяют и обрабатывают 0,5 н. растворомсерной кислоты порциями по 10 и 5 мл 4-5 раз (по 5 мин) при интенсивном
перемешивании жидкости.
Сернокислый реэкстракт отделяют в мерную колбу емкостью 25-50 мл. Полноту реэкстракции производных фенотиазина и их метаболитов проверяютреакцией окрашивания реэкстракта с концент. серной кислотой (вфарфоровой чашке). Реэкстракт полностью освобождают от следов эфира ос
торожным нагреванием при 50-60°С в течение 3 мин. на водяной бане. Объемреэкстракта доводят до метки 0,5 н. раствором серной кислоты и исследуют.
