Файл: Общая характеристика группы веществ, изолируемых из биологического материала настаиванием с полярными растворителями.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.11.2023
Просмотров: 281
Скачиваний: 5
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Общие методы Изолирование методом Стасса-Отто подкисленным этиловым спиртом
В колбу вносят 100 г измельченного биологического материала, который заливают 96-градусным или абсолютным этиловым спиртом до покрытия имтвердых частичек объекта. Смесь биологического материала и этиловогоспирта подкисляют 10% спиртовым раствором щавелевой или винной кислоты до рН=2-3 и оставляют, часто взбалтывая, на 15-20 мин. Затем проверяют
кислотность смеси при помощи универсального индикатора. Для этого беруткаплю вытяжки, прибавляют каплю дистиллированной воды и этой смесьюсмачивают бумагу, пропитанную универсальным индикатором. При необходимости смесь биологического материала и спирта снова подкисляют 10%спиртовым раствором щавелевой или винной кислоты до рН=2-3.Колбу с содержимым неплотно закрывают пробкой и при периодическомвзбалтывании оставляют на сутки в теплом месте (25-3 0°С). После указанного времени снова проверяют кислотность содержимого колбы. Если содержимое колбы имеет кислую реакцию (рН=2-3), то с твердых частичек биологического материала сливают спиртовую вытяжку. После чего биологиче
ский материал заливают новой порцией этилового спирта, подкисляют10%-м спиртовым раствором щавелевой или винной кислот до рН=2-3 и оставляют на сутки. Настаивание биологического материала с новыми порциями подкисленного спирта производят 3-4 раза.
Спиртовые вытяжки соединяют, а оставшийся биологический материал промывают спиртом, который приливают к соединенным спиртовым вытяжкам.Эти вытяжки фильтруют через небольшой бумажный фильтр. Фильтрат переносят в фарфоровую чашку и выпаривают на водяной бане (35-40°С) догустоты сиропа. Для экономии спирта фильтрат можно перенести в колбу ипод вакуумом отогнать спирт до получения сиропообразной жидкости. К
жидкости, перемешиваемой стеклянной палочкой, по каплям прибавляют 96-градусный или абсолютный спирт до прекращения осаждения белковых веществ. Если одновременно прибавить большое количество спирта, то выпадет осадок белковых веществ в виде сгустков. Этот осадок может увлекать израстворов исследуемые вещества. После отстаивания жидкости с осадком ее
фильтруют, осадок на фильтре промывают спиртом. Фильтрат снова выпаривают до густоты сиропа, а затем по каплям добавляют спирт и фильтруют.Упаривание спиртовой жидкости до густоты сиропа и обработку ее спиртомпроизводят до тех пор, пока не прикатится выпадение осадка. После этого жидкость фильтруют и прибавляют 20-25 мл воды.
• Кислую водно-спиртовую жидкость, очищенную от белковых веществ и других примесей, переносят в делительную воронку и 3-4 раза взбалтывают схлороформом (порциями по 10-15 мл). Полученные при этом хлороформныевытяжки соединяют и исследуют на наличие токсикологически важных веществ.
16. способы выделения лекарственных соединений из биологических жидкостей. Схема исследования мочи на производные барбитуровой кислоты.
Изолирование по методу А.А. Васильевой водой, подкисленной щавелевой кислотой
В коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала,прибавляют двойное количество дистиллированной воды. Содержимое колбы хорошо перемешивают и подкисляют 5-10% водным раствором щавелевой кислоты до рН=2,5 (по универсальному индикатору). Смесь оставляют на2 ч при периодическом помешивании содержимого колбы. Затем с твердых частичек объектов сливают кислые водные вытяжки и процеживают их через марлю или небольшой ватный тампон. Твердые частички исследуемых объектов промывают водой (15-20 мл). Промывные воды присоединяют к кис лым водным вытяжкам.
Эти вытяжки переносят в делительные воронки и взбалтывают с тремя пор циями хлороформа (15, 10 и 10 мл). Хлороформные вытяжки соединяют и фильтруют через небольшой фильтр (диаметр 5-6 см), редварительно смо ченный хлороформом. Фильтраты собирают в сухие колбы. Полученные та ким образом хлороформные вытяжки исследуют на наличие веществ, экстра ирующихся хлороформом из кислых водных растворов.
Оставшиеся в делительных воронках кислые водные вытяжки, из которых хлороформом предварительно экстрагированы примеси и некоторые токси кологически важные вещества, подщелачивают 25% раствором гидроксида аммония до рН=8,5-9,0 и взбалтывают с тремя порциями хлороформа (15, 10 и 10 мл). Хлороформные вытяжки соединяют, фильтруют через бумажный фильтр, смоченный хлороформом, и исследуют на наличие токсикологическиважных веществ, экстрагирующихся из щелочной среды.
Частные методы
Изолирование производных барбитуровой кислоты по методу В.И. Поповой водой, подкисленной серной кислотой
В стакан органа трупа, прибавляют 80 мл 0,02 н. раствора серной кислоты, перемешивают и измеряют рН. При необходимости рН смеси доводят до 2-3 (по универсальному индикатору) 30% растворо серной кислоты, настаивают в течение двух часов при частом перемешива нии стеклянной палочкой. Через 2 часа вытяжку сливают, а биологический материал еще дважды заливают новыми порциями 0,02 н. раствора сернойкислоты (по 80 мл) и каждый раз смесь доводят до рН=2-3, а затем настаива
ют по одному часу.
Очистка вытяжек. Вытяжки объединяют, процеживают через сложенную в 3слоя марлю и центрифугируют в течение 25-30 минут (13-15 тыс. об/мин).Центрифугированную вытяжку очищают методом гель-хроматографии. Закрепленную в штативе колонку на одну треть заполняют 0,02 н. раствором серной кислоты и вносят суспензию ранее приготовленного геля Сефадекса G—25 (50 г с размером частиц 100-300 мкм заливают 0,02 н. раствором серной кислоты на 3 часа). После того, как в колонке осядет слой геля высотой 40 см, поверх геля помещают кружок фильтровальной бумаги. В колонке над гелем обязательно должен быть небольшой слой 0,02 н. раствора серной кислоты, который служит для защиты геля от попадания воздуха и высыхания. Во избежание перегрузки колонок с гелем большими объемами вытяжек, очистку 200 мл вытяжки производят в 4 приема (по 50 мл каждый прием). В колонку вносят 50 мл вытяжки и затем 2 раза по 2 мл 0,02 н. раствора серной кислоты (обеспечивает полное впитывание вытяжки гелем).
Элюирование производных барбитуровой кислоты. Колонку соединяют с сосудом, установленным выше нее и заполненным 0,02 н. раствором серной кислоты. Первые 150 мл элюата отбрасывают (в них содержатся примеси), а последующие 200 мл элюата собирают в стакан и переносят в делительную воронку емкостью 1000 мл. Затем таким же образом на той же колонке геля " очищают следующие 50 мл вытяжки и 200 мл элюата переносят в ту же делительную воронку. Из объединенного элюата (400 мл) барбитураты 3 раза экстрагируют хлороформом по 50 мл в течение 7-10 минут. В случае образования эмульсии, ее разрушают центрифугированием. Для освобождения хлороформной вытяжки от влаги в нее вносят 5-7 г безводного сульфата натрия и взбалтывают в течение 2-3 минут. Затем хлороформную вытяжку сливают с сульфата натрия в другой стакан, сульфат натрия промывают небольшим количеством хлороформа и этот хлороформ прибавляют к основной хлороформной вытяжке. Хлороформную вытяжку выпаривают досуха.
■ При исследовании гнилостно-разложившегося биологического материала проводят дополнительную очистку хлороформных вытяжек. Для этого хлороформные вытяжки 2 раза взбалтывают в течение 5-7 минут с 0,1% раствором едкого натра (по 25 мл). Затем водную вытяжку подкисляют 30% раствором серной кислоты до рН=2-3. Производные барбитуровой кислоты трижды экстрагируют хлороформом по 30 мл в течение 7-10 минут. Хлороформные извлечения объединяют, взбалтывают сддуль.,фатом,нахр.йЯ,. а затем выпаривают досуха. В сухом остатке проводят качественный анализ на наличие производных барбитуровой кислоты.
Изолирование производных барбитуровой кислоты по методу P. Valov водой, подщелоченной гидроксидом натрия
Тщательно измельчают 100 г исследуемого органа и смешивают со 180 мл дистиллированной воды и 20 мл 10% раствора едкого натра. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 минут в химическом стакане, затем центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин.
В центрифугат при постоянном перемешивании постепенно вводят 120 мл 10% раствора вольфрамата натрия и не менее 100 мл 1 н. раствора серной кислоты до рН=2. Стакан помещают на 20 мин на кипящую водяную баню и центрифугируют в течение 30 мин
Центрифугах сливают через ватный тампон, смоченный водой, в делительную воронку, тампон промывают 10 мл дистиллированной воды, и объединенные водные извлечения ркстрагирщот^равным объемом эфира в течение 15 мин.
Затем барбитураты реэкстрагируют 50 мл 10% раствора едкого натра. Щелочной раствор подкисляют 25% раствором серной кислоты до рН=2 и барбитураты вновь реэкстрагируют равным объемом эфира. Эфирное извлечение фильтруют в мерную колбу емкостью 50 мл. Объем доводят до метки эфиром. В объединенном извлечении проводят обнаружение производных барбитуровой кислоты.
Изолирование производных фенотиазина по методу Е.М. Саломатина спиртом, подкисленным щавелевой кислотой
100 г мелкоизмельченного органа обрабатывают последовательно тремя порциями этанола, подкисленного до рН=2-3 (по универсальному индикаторуили по рН-метру) 10% спиртовым раствором щавелевой кислоты.
Спиртовые извлечения отделяют декантацией, объединяют и выпаривают наводяной бане при температуре 60°С (при специальном задании исследованияна аминазин, а также на другие производные фенотиазина) до густоты сиропа. Операцию осаждения сопутствующих веществ абсолютным или 96° эти
ловым спиртом проводят 2-3 раза. Спиртовое извлечение выпаривают досухаили до густой консистенции. Остаток обрабатывают 80-100 мл теплой(40-60°С) дистиллированной воды и, после охлаждения до комнатной температуры, количественно отфильтровывают в делительную воронку.
Для десорбции аминазина и его метаболитов, частично сорбированныхфильтровальной бумагой, фильтр обрабатывают 10-20 мл воды, подкисленной 5% раствором щавелевой кислоты до рН=2-3, и производят двукратнуюэкстракцию эфиром порциями по 50 мл. Кислую эфирную фракцию обезво
живают и в случае необходимости исследуют на наличие производных барбитуровой кислоты и отдельных алкалоидов.
Кислое водное извлечение подщелачивают 50% раствором едкого натра дорН=13 и экстрагируют 3-4 порциями эфира (по 1/3 от объема водной фазы).Эфирные извлечения отделяют, объединяют и обрабатывают 0,5 н. растворомсерной кислоты порциями по 10 и 5 мл 4-5 раз (по 5 мин) при интенсивном
перемешивании жидкости.
Сернокислый реэкстракт отделяют в мерную колбу емкостью 25-50 мл. Полноту реэкстракции производных фенотиазина и их метаболитов проверяютреакцией окрашивания реэкстракта с концент. серной кислотой (вфарфоровой чашке). Реэкстракт полностью освобождают от следов эфира ос
торожным нагреванием при 50-60°С в течение 3 мин. на водяной бане. Объемреэкстракта доводят до метки 0,5 н. раствором серной кислоты и исследуют.
Общие методы Изолирование методом Стасса-Отто подкисленным этиловым спиртом
В колбу вносят 100 г измельченного биологического материала, который заливают 96-градусным или абсолютным этиловым спиртом до покрытия имтвердых частичек объекта. Смесь биологического материала и этиловогоспирта подкисляют 10% спиртовым раствором щавелевой или винной кислоты до рН=2-3 и оставляют, часто взбалтывая, на 15-20 мин. Затем проверяют
кислотность смеси при помощи универсального индикатора. Для этого беруткаплю вытяжки, прибавляют каплю дистиллированной воды и этой смесьюсмачивают бумагу, пропитанную универсальным индикатором. При необходимости смесь биологического материала и спирта снова подкисляют 10%спиртовым раствором щавелевой или винной кислоты до рН=2-3.Колбу с содержимым неплотно закрывают пробкой и при периодическомвзбалтывании оставляют на сутки в теплом месте (25-3 0°С). После указанного времени снова проверяют кислотность содержимого колбы. Если содержимое колбы имеет кислую реакцию (рН=2-3), то с твердых частичек биологического материала сливают спиртовую вытяжку. После чего биологиче