Выделение и очистка геномной ДНК из фруктов и овощей
Цель лабораторной работы ознакомиться с методикой выделения ДНК из фруктов и овощей для получение очищенного препарата ДНК.
Принцип метода: Клеточные стенки, плазматические и ядерные мембраны разрушаются при гомогенизации растительных тканей в блендере. При этом, детергент, содержащийся в гомогенизационном буфере, разрушает клеточную мембрану и превращает в эмульсию липиды и белки клетки, разрушая полярные и гидрофобные взаимодействия, которые скрепляют клеточную мембрану. Далее, ДНК может быть отделена от хромосомных белков химическими компонентами, содержащимися в буфере для гомогенизации, которые осаждают белки из раствора.
Материалы и оборудование.

Следующие материалы необходимы для каждого студента или пары студентов:

Материалы	Оборудование
Буфер для гомогенизации 100 мл (додецил сульфат натрия-5г, хло рид натрия-0.877г, цитрат натрия-0.41г, ЭДТА-0.029г.) Овощи и фрукты 95%-ый этанол выдержанный при 20 оC.	Блендер/гомогенизатор 60оC водяная баня Ёмкость со льдом, Весы (0.1-граммовая шкала) Перчатки, нож, воронка, марля (4 слоя) Цилиндр на 100 мл (для этанола), Стакан на 250 мл, стакан на 500 мл Стакан на 100 мл, Стеклянная палочка

Методика выделения геномной ДНК из тканей лука для качественного анализа.

1. 
   Наденьте перчатки, порежьте овощ или фрукт среднего размера на кубики, не более 3 см шириной. Перчатки предотвращают попадание ферментов дезоксирибонуклеазы с Ваших рук в образец ДНК и не допускают разрушения ДНК на маленькие фрагменты.
   
2. 
   Взвесьте 50 г нарезанного кубиками овоща или фрукта. Перенесите весь взвешенный материал в стакан объёмом 500 мл.
   
3. 
   Добавьте 100 мл буфера для гомогенизации к нарезанному препарату и инкубируйте стакан на водяной бане в течение 15 минут (не больше!). Эта термообработка смягчает ткань и делает возможным проникновение буфера для гомогенизации. Эта процедура также денатурирует многие ферменты, которые могли бы помешать процедуре выделения.
   
4. 
   Быстро охладите образец до 15-20^оC в ледяной ёмкости (в смеси льда и воды). Эта процедуру нужно проводить приблизительно 6 минут для предотвращении ДНК денатурации.
   
5. 
   Вылейте охлажденный образец в блендер или оставьте в этом же стакане на 500 мл (если блендер без стакана) и закройте крышкой. Гомогенизируйте в течение 45 секунд на низкой скорости, затем 30 секунд на высокой скорости. Гомогенизация разрушает клеточную мембрану и освобождает содержимое клеток (углеводы, белки, жиры, и нуклеиновые кислоты).
   
6. 
   Вылейте гомогенат из блендера в стакан на 250 мл. Оставьте его в ледяной ёмкости на 15-20 минут.
   
7. 
   Пропустите гомогенат через четыре слоя марли в новый стакан на 100 мл, следя за тем, чтобы пена осталась на марле.
   

---

Осаждение ДНК.

Гомогенат должен содержать только ДНК и компоненты среды для гомогенизации. Из компонентов, находящихся в гомогенате, только ДНК не растворима в этаноле выдержанном в морозильной камере. Поэтому, когда этот «ледяной» этанол добавляется к гомогенату, все компонены гомогената растворяются – кроме ДНК.

Если инструкциям следовали тщательно, и молекулярная структура ДНК осталась неповрежденной, генетический материал должен выпасть в осадок как толстая, волокнистая, белая масса, которую можно намотать на стеклянную палочку или железную петлю.
Если же ДНК была повреждена, она также выпадет в осадок, но как белая, бесформенная масса, которая не может быть собрана на стеклянную палочку.

8. 
   Поместите свой стакан с отфильтрованным гомогенатом в ёмкость со льдом. Оставьте его охлаждаться, пока температура гомогената не достигнет 10-15^оC (приблизительно 10- 15 минут).
   
9. 
   Отмерьте 80 мл этанола (охлаждённого предварительно в морозилке при –20оС) в мерный охлаждённый цилиндр на 100 мл. Медленно добавляйте этанол по краю стакана на 100 мл или мензурки, пока белая, волокнистая ДНК не выпадет в осадок. Возможно, не потребуются всех 80 мл спирта, чтобы осадить ДНК.
   
10. 
    Попробуйте намотать волокнистую ДНК на стеклянную палочку, вращая ее в стакане только в одном направлении.
    
11. 
    Полученную ДНК можно хранить в холодильнике для демонстрации качественного выделения ДНК. Также с этой ДНК можно провести электрофорез на агарозном геле и продемонстрировать отличие геномной от плазмидной ДНК.
    

---

Смотрите также файлы

• Отчет по преддипломной практике Выполнил студ гр. Ббп1902 Е. Э. Леонова Принял канд техн наук.docx

• Эпоним дающий чемулибо свое имя, происходит от греческого onoma имя.docx

• Производство по административным делам об оспаривании результатов определения кадастровой стоимости.docx

• Отчет о прохождении учебной производственной практики профессиональный модуль.docx

• Программа основных мероприятий в мку ЦКиД.docx