ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 05.12.2023
Просмотров: 45
Скачиваний: 1
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Функционирование белков
Лиганд+центр связывания белка (активный центр белка АЦБ)
АЦБ-относительно изолированный участок белковой молекулы в ее кармане из аминокислотных остатков с радикалами на определенном участке (ансамбль), образуя рельеф (способен комплементарно связываться с лигандом)
-
Доступа воды нет -
При денатурации разрушается -
Располагается между доменами
Лиганд должен соответствовать активному центру полностью или частично (активный центр может подгоняться- конформационная лабильность)
Связи: ковалентные и слабые не ковалентные (гидрофобные водородные и ионные)
Виды лигандов:
-
Неорганические и органические (низко и высокомолекулярные) -
Изменяющие структуру при присоединении к АЦБ -
Присоединяющиеся в момент функционирования
Если невозможно присоединение лиганда имеется:
-
Кофактор- ион металла -
Кофермент- органическая не белковая молекула -
Простетическая группа- не белковая часть, прочно связанная с АЦБ и необходимую для его функционирования
Соединение протомеров - это присоединение лигандов
Иногда присоедиенение лигандов изменяет конформацию белка -> формируется центр связывания с другими лигандами (кальмодулин после связывания с кальцием может связываться с ферментами)
Вещества влияющие на функционирование белков
Ингибитор белка- лиганд взаимодействующий с белком и нарушающий его функцию
Конкурентный ингибитор белка- аналог замещающий естественный лиганд в АЦБ и снижающий его функцию
Антагонитст (уменьшают эффект) и анагонист (усиливают эффект)
Длительное действие за счет более медленной инактивацией и разрушением в организме
Многообразие белков
Классификация
По форме: от соотношения продольной оси к поперечной
| Глобулярные | фибрилярные |
| 1:10 (1:3 или 1:4) | Более 1:10 |
| большинство | Меньшинство |
| Компактная структура и растворимы (кроме мембранных) | Вытянутая форма и не растворимы |
| Альбуминны, полифункциональные глобулины, гистоны, протамины, проламины, глутемины | Миозин, фибрин |
По химическому строению:
| Простые | сложные |
| Полипептидные цепи | Полипептидные цепи + простетическая группа |
| | |
| | |
По функциям:
-
Ферменты -
Регуляторные белки: гормоны, присоединение к другим белкам меняя их активность и регуляторные днк связующие белки -
Рецепторные белки: сигнальные молекулы (гормоны неромедиаторы) взаимодействуют с белками рецепторами -
Транспортные: перенос лигандов, молекулы плохо растворимые в воде, гидрофильных в-в через гидрофобные мембраны -
Структурные: коллаген и эластин -
Защитные: ИГ фибриноген тромбин -
Сократительные: актин и миозин- фибрилярные белки и тубулин- микротрубочек -
Энергетическая
По локализации в клетке: ядерные цоплазматические и тд
По локализации в организме: крови печени и тд
По возможности адаптивно регулировать: конститутивные и индуцибельные
По продолжительности жизни быстро обновляются и медленно
Семейства белков (сериновых протеаз суперсемейство иммуноглобулинов семейство иммуноглобулинов Т клеточных антигенраспознающих рецепторов HLA изофункц белки
Физико-химические свойства белков и методы их выделения
Растворимость зависит от:
-
Форма молекул -
Молекулярная масса -
Суммарный заряд -
Соотношение полярных и не полярных групп на поверхности нативных молекул белков -
Состав растворителя
Методы выделения и очистки белков
Методы разрушения тканей и экстракции белков
| Гомогенизация биоматериала | PH, C солей, сосуд в котором растирает пестик |
| Метод замораживания и оттаивания тканей | Кристаллизация разрушает ткани, центрифугированием осаждают осадок |
| Экстракция белков св с мембранами на протомеры | Детергенты (разрушают гидрофобные св в олигомерных белках) |
| Удаление из раствора небелковых в-в | Используя физ-хим св-ва |
Методы отчистки белков
-
Проводится при низко температуре (избежать денатурации)
| Избирательная денатурация | 50-70 С или PH 5.0 удаляет большинство белков |
| Высаливание | (NH4)2SO4, чем больше р-сть тем больше конц соли. Соли щм щзм вызывают обратимое осаждение |
| Гель фильтрация или метод молекулярных сит | |
| Ультрацентрифугирование | |
| Электрофорез | |
| Ионообменная хроматография | |
| Аффинная хроматография или хроматография по сродству | |
Количественное определение белков
Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:
-
спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка; -
рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации; -
нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации; -
поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.
Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков
-
Биуретовая реакции. Метод основан на биуретовой реакции, образующей в щелочной среде окрашенные в фиолетовый цвет комплексы пептидных связей с ионами меди (II). Он известен в двух модификациях: макрометод и микрометод. Макрометод (макроопределение) применяют в случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (1-10 мг/мл); Микрометод позволяет определить в 4 мл щелочного раствора 0,1-2 мг белка. На окраску, даваемую белками, оказывают влияние соли аммония, сахароза, глицерин и др. Ниже приведено описание макрометода. -
метод Лоури. В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку — 10 — 100 мкг/мл. -
Метод Бредфорда. Метод основан на реакции красителя кумасси (coomassie) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе. Метод даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения адсорбции от концентрации, в целом чувствительность метода зависит от соотношения концентраций определяемого белка и красителя: чем больше красителя, тем чувствительней метод), менее «капризный» по сравнению с методом Лоури. -
метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора. -
3 % р-р сульфосалициловой кислоты дает помутнение -
Пирогаллоловый метод ( краситель пирогаллоловый красный связывается с + заряженными аминогруппами- красное окрашивание)
Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).
Навеску анализируемого материала кипятят с концентрированной серной кислотой. При этом углерод органических веществ окисляется до диоксида углерода, водород – до воды; азот (отрицательно заряженный трехвалентный) превращается в аммиак, который с серной кислотой, взятой в избытке, образует сульфат аммония. Минерализованную пробу затем подщелачивают, аммиак отгоняют в раствор кислоты, где определяют титрованием.
Азот нитратов и нитритов, ядер гетероциклических соединений в ходе этого процесса в аммонийную соль не превращается.
ДРУГИЕ:
Гравиметрические методы (выделения; осаждения; отгонки)
Гравиметрические (весовые) методы определения общего белка сыворотки основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови.
Титриметрический метод- на основе всех видов реакций (перенос водорода эелектрона эл пары и процессы осаждения)
Особенности функционирования олигомерных белков на примере Гемоглобина
| Гемоглобин | Миоглобин |
| 4ая структура (тетрамер) | 3ая структура (мономер) |
| Сходное происхождение | |
| Функция | |
| Сходная конформация отдельных цепей | |
Структура Миоглобина
| Простетическая группа - Гем | Белковая часть |
| | Глобулярный белок |
| | 1 полипептидная цепь |
Клеточная локализация и функции
Р-н в красных мышцах
F: запас кислорода (мыш работа- падение парциального P O2 – О2 освобождается – исп митохондрии- энергия для мышц)
Строение миоглобина
| Гем (не белковая часть) | Апомиоглобин (белковая часть) |
| Циклический тетрапиролл | 8 альфа-спиралей |
| Протопорфирин 9 | А-Н с N конца (Гис F8) |
| | 3ая стр. -Компактная глобула без св места |
| | Вн ч.- гидрофобные R (не дают проникнуть Н2О тк Fe2+ -Fe3+ - не прис О2) (Кроме 2ух Гис в АЦБ) |
Связывание гема с апомиглобином
Гем- специфический лиганд апомиоглобина
Р-н между F и E
Центр связывания образован:
-
Гидрофобные остатки АК -
2е боковые ионизированные (ph 7.34) гр пропионовых к-т выступают на поверхность (соединены с 2уосновными АК Белковой части) -
Гис Е7 (не связан с гемом; для присоединения О2) Гис Е8 (Fe2+ - Атом N имидазольного кольца)
Структура и функции гемоглобина
Р-н: эритроциты чел и позв жив
F:
-
Перенос О2 из легких в переферические ткани -
Перенос СО2 и протонов из периферических тканей -
Способность регулировать сродство к О2 в зависимости от тканевых условий
(сильный окислитель)
Гемоглобины человека:
В эритроцитах 90% от всех белков клетки
-
Гемоглобин А: тетрамер 2альфа2бета 98% у взрослых -
Гемоглобин А2: 2альфа2дельта 2% у взрослых -
Гемоглобин А1с: гликолизированный гемоглобин А
Гемоглобины во внутриутробном развитии
-
Эмбриональный гемоглобин: эмбриональный желточный мешок, 2кси2эпсилон - через 2 нед печень Гемоглобин F – 6 мес F заменяет ЭГ -
Гемоглобин F- печень костный мозг до рождения- гемоглобин А (8 мес)- после рождения А заменяет F. 2альфа2гамма
Строение Гемоглобина А
Строение протомеров Гемоглобина сходно с апомиоглобином:
Протомер: 8 спиралей плотная глобула внутреннее гидрофобное ядро карман для гема
Соедениение с гемом: гидрофобное окружение гема кроме Гис 7 и Гис 8
Роль Гис Е7 в функционировании миоглобина и гемоглобина:
-
Гем+СО (в 25000 р сильнее тк атомы Fe2,C,O в одной плоскости) -
чем Гем+О2 (под углом) -
Гис Е7 рн над Fe2+ в обл присоединения О2=> нарушается оптимальное положение СО в АЦБ и оптимальные условия для присоединения О2 -
Итого: СО (в 200р) чем О2 -
Уменьшение сродства с СО связано с эндогенным СО который блокирует гемсодержащие белки (после уменьшения 1%)
Четвертичная структура гемоглобина
2альфа2бета- каждая альфа с 2мя бета
Между Альфа1 и бета 1; Альфа 2 и бета 2- много гидрофобных радикалов –> гидрофобные взаимодействия, а также ионные и водородные -> обр димеры альфа1бета1 и альфа2бета2- между димерами полярные св (ионные и водородные) (при изменении Ph- рвутся св между димерами)
-
Димеры перемещаются относительно дд -
Поверх протомеров не ровная => В центр области- центральная полость ч-з всю молекулу