ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 10.03.2024
Просмотров: 418
Скачиваний: 2
Корд-фактор характерен также и для атипичных микобактерий, хотя его проявления менее выражены, чем у патогенных штаммов. Так, М. phlei,M.vaccaиM.xenopiпри культивировании образуют микроколонии в виде «кос» и «жгутов», но их ширина составляет 40 мкм, 2-5 мкм и 5 мкм соответственно.
В ряде литературных источников [21, 34, 69] констатируется, что образование жгутов при выращивании микобактерий, связанное с корд-фактором, является подтверждением патогенности бактерий. Однако исследованиямиBrambilla C. и соавт., (2012),[51] проведенных с помощью сканирующей электронной микроскопии было показано образование жгутов с образованием истинных связок при выращивании микобактерий, не относящихся к туберкулезным: Mycobacterium brumae и Mycobacterium fallax.
Строение клеточной стенки микобактерий
Обобщая обширные литературные данные о клеточной стенке микобактерий можно констатировать, что она – самая сложная по сравнению с оболочкой клеток остальных прокариот. Так, если грамотрицательные бактерии имеют две мембраны, клеточная стенка микобактерий состоит из нескольких слоев, часть из которых содержит сахара и имеет относительно постоянный состав. Наружные слои состоят из липидов, в основном миколовых кислот и их производных и характеризуются вариабельностью химического состава. При классической электронной микроскопии эти слои, как правило, не видны (электроннопрорсвечиваемый слой, зона низкой плотности). Каркас клеточной стенки составляют пептидогликаны (электронноплотный слой) и связанные с ними арабиногалактаны (полисахаридная строма), к которым крепятся миколовые кислоты и их производные. Миколовые кислоты присутствуют в клеточной стенке также в виде сульфолипидов и корд-фактора. Кроме того, в состав клеточной стенки входит липоарабиноманнан(LAM), который крепится на плазматической мембране, пронизывает всю клеточную стенку и выходит на ее поверхность. Биологическая роль конечных фрагментов липоарабиноманнана, в основном его маннозных радикалов, состоит в подавлении активации Т-лимфоцитов и лейкоцитов крови, что приводи к нарушению иммунного ответа на микобактерии[36].
Было также установлено, что около 10–15% массы оболочек микобактерий составляют пептиды, не входящие в состав муреина, хотя ковалентно связаны с ним и могут быть разрушены протеолитическими ферментами.
У вирулентных микобактерий в оболочке содержится полиглутаминовая кислота, составляющая несколько процентов от массы оболочек. Оболочка микобактерий имеет толщину 20–40 мкм и состоит из 3 и более слоев, выявляемых на срезах бактерий. Распределение различных компонентов оболочки в этих слоях до конца не установлено, но поверхность клеток гидрофобна.
Существование внешней двухслойной мембраны микобактерий было постулировано уже давно, но с помощью электронной микроскопии ультратонких срезов этого нельзя было непосредственно наблюдать. B. Zuberи соавт. (2008)[61] использоваликрио-электронную микроскопию с образованием стекловидного льда (CEMOVIS) для подробного ультраструктурного анализа трех видов бактерий подотряда Corynebacterineae, а именно, Mycobacterium bovis БЦЖ, Mycobacterium smegmatis и Corynebacterium glutamicum. При этом было установлено, что миколовые кислоты связаны с комплексом пептидогликаны-арабиногалактаны микобактерий нековалентны и имеют важное значение для формирования внешней мембраны. Кроме того, в зернистом слое и зоне низкой плотности проявляется периплазматическое пространство. На основании этих исследований авторы предлагают модель организации липидов в наружной мембране (рис. 5) и подчеркивают, что она должна служить ориентиром для будущих исследований, направленных на определение связи структуры клеточной оболочки микобактерий и ее функции.
Рис. 5. Модель–«молния» углеводородных цепей липидов клеточной стенки (в маштабе) микроорганизмов подотрядаCorynebacterineae у – микобактерий (А) и коринебактерий (В). (Черный цвет –миколовые кислоты; темно-синий – фосфолипиды (16 - до 18-углерод-длинные цепи); темно-серый – комплекс пептидогликанов-арабиногалактанов, светло-голубой – гликопептидолипиды, светло-серый – порин, оранжевый – трегалозодимиколат, красный – трегалозомономиколат) [61].
Оболочка микобактерий обладает высокой биологической активностью, в т.ч. адъювантной. Miyauchi M, и соавт. (2011) [46] установили иммуностимулирующее и ададьювантное действие арабиномиколовых кислот, выделенных из клеточной стенки микобактерий BCG путем кислотного гидролиза. Было показано, что они содержат такие фракции как моно-арабинозы миколат, пента-арабинозы тетрамиколат и гекса-арабинозы тетрамиколат. Введение мышам арабиномиколовых кислот индуцировало фактор некроза опухоли (ФНО-α) на уровне, сравнимом с BCG, а также повышало реакцию гиперчувствительности замедленного типа на опухолевые клетки.
Широко известен и используется полный адъювант Фрейнда, состоящий из убитых клеток микобактерий (обычно БЦЖ), добавленных к неполному адъюванту. Последний представляет собой суспензию минерального масла в воде, содержащий антиген. Добавление клеток микобактерий значительно усиливает эффект адъюванта. Введение клеток БЦЖ в маслянной эмульсии придает животным неспецифическую устойчивость к инфекции, в т.ч. к заражению неродственными микобактериями. Этот эффект отчасти зависит от присутствия «корд-фактора». Подобной активностью не обладает ни одна биологическая субстанция.
В последнее время установлено, что клетки микобактерий туберкулёза, их фрагменты и компоненты, в т.ч. «корд-фактор», обладают антиопухолевой активностью, что связано частично с цитотоксичностью, проявляющейся на уровне митохондрий.
В то же время остается до конца не выясненным вопрос о устойчивости микобактерий к высоким температурам, сопряженный с проблемой безопасности применения туберкулина. Так, В. В Власенко (1998) ) [9] и А.П. Лысенко и соавт. (2007) [13] учитывая результаты изучения термической устойчивости возбудителя туберкулеза путем посева на авторскую питательную среду ВКГ автоклавированных препаратов и туберкулинов, а также исследовании свойств полученных культур микобактерий приходят к следующим выводам:
– автоклавирование при 120 С инактивирует патогенные формы возбудителя туберкулеза, но не предотвращает образование жизнеспособных защитных форм микобактерий типа спор;
– инкубирование автоклавированных препаратов возбудителя туберкулеза в симуляторе роста ВКГ и посев на питательную среду ВКГ обеспечивают прорастание адаптивных форм, имеющих общие антигены и участки ДНК с бактериальной формой возбудителя;
– изоляты, выделенные из образцов туберкулинов способны персистировать в организме морских свинок и в ряде случаев вызывать ГЧЗТ к туберкулину и частично восстанавливать кислотоустойчивость.
Однако возможность восстановления патогенности этими адаптивными формами возбудителя туберкулеза установлена не была.
Оценивая публикации об особенностях устойчивости возбудителей туберкулеза к антимикобактериальным факторам физической и химической природы приходим к выводу, что каждая научная статья вносит свою лепту в познание до сего времени таких «непознанных» биологических свойств как сохранение вида в постоянно меняющейся биологической и абиотической среде. Среди них экспериментальные работы вышеназванных авторов о термической устойчивости микобактерий, по нашему мнению, относятся к побуждающим активизацию фундаментальных исследований по проблеме туберкулеза человека и животных.
Появление этих и предыдущих публикаций вышеназванных авторов о воссоздании живых M. bovis после автоклавирования при 120 С в течении 30 мин., а также туберкулинов различных производителей вызвало всплеск дискуссий, подобно тем, которые были в конце XIX–начале ХХ столетий после сообщений в 1891 годуStrausи Cameliaо способности автоклавированных микобактерий вызывать у животных «некротуберкулез» иCranher,Ledoux-Lebard(1901 г.), – о способности высушенной культуры возбудителя туберкулеза сохранять жизнеспособность после пребывания в среде при температуре 100 С.
Далеко не научной критикой, при отсутствии дискуссии и теоретических доводов, в свое время было встречено сообщение Г.М. Бошьяна (1949) о возможности выращивания микобактерий на питательной среде после посева туберкулина [6].
Большинство не согласных с данными этих авторов высказывали свое мнение, как правило, кулуарно, обходя научные и «печатные» трибуны. Среди тех, кто вступил в публичную дискуссию с авторами ХХIвека, был профессор, академик Национальной академии аграрных наук Украины Бусол В.А. в статье «Суд над туберкулином» [8] привел доводы не столько о неспособности M. bovis расти после автоклавирования, сколько о невозможности сохранять такое свойство как вирулентность, а также другие видовые свойства возбудителя инфекции.
В публикациях отсутствовали теоретические доказательства способности болезнетворных микобактерий сохранять вид, а также генотипичные и фенотипичные свойства после воздействия температур выше 100 С0, что может быть связано с отсутствием исследований в этом направлении на молекулярном уровне. В преддверии выхода названных публикаций бытовала еще классическая биология, в которой, как утверждает А. Хорст (1982), преобладали абстрактные представления о «жизненных» процессах. В молекулярной биологии понятие «жизненного» процесса в макро– и микроорганизме заменяется обычными физико-химическими представлениями. Это позволяет формировать новый методический подход при изучении проблем патогенеза болезней заразной и незаразной патологии и распознать развитие патологии в системной биологической цепочке: геном–клетка–организм. В связи с этим автор отмечает, что генетический код, репликация ДНК, процессы транскрипции и трансляции достаточно сложны и заключают в себе столько возможностей их нарушения и только постоянная аутокоррекция способна препятствовать этому. Что касается механизмов репарации нуклеиновых кислот, то они так же важны, как и механизмы репликации и трансляции. Поэтому понимание этих и других процессов изменения в структуре ДНК может существенно расширить наши знания о действии на микроорганизмы высоких температур [40].
Учитывая вышесказанное, для более глубокого понимания биологии M. bovis и механизмов его устойчивости к различным факторам, в т.ч. и высокотемпературным, необходимы новые методические подходы, базирующиеся на молекулярных механизмах, особенно изменчивости и устойчивости ДНК.
Особенности капсулы микобактерий
По данными литературы [69; 70; 73; 78] все микобактерии обладают очень своеобразной капсулой из молекул жирных кислот, структура и функция которых до конца не изучена. Эта оболочка позволяет микобактериям выдерживать весьма суровые условия окружающей среды и выживать внутри клеток иммунной системы человека и животных (макрофагов), где все другие микробы погибают, будучи растворены с помощью ферментов. Помимо этого, капсула микобактерий кислотооустойчива и не пропускает обычные антибиотики.
При исследовании с помощью электронного микроскопа динамики фагоцитоза микобактерий туберкулеза человека, крупного рогатого скота и других патогенных микобактерий было обнаружено формирование электрон-просвечиваемой зоны (electron transparentzone, ETZ) (рис. 6).
Рис. 6. Вид колонии микобактерий (срез) под электронным микроскопом (Mycobacterium bovis) с видимой капсулярной и электрон-просвечиваемой зоной (ETZ)
Многие авторы связывают наличие ETZс резистентностью микобактерий к ферментам фагоцитов, что обуславливается архитектоникой клеточной стенки. В ранних исследованиях этого феномена высказывалось предположение, [78], что сульфатиды и полиглутаминовая кислота клеточной стенки микобактерий туберкулеза могут быть вовлечены в феномен торможения слияния между фагосомами и лизосомами. В то же время у М. leprae и М. lepraemurium, у которых такого торможения не наблюдалось, было установлено наличие широкой ETZ, которая состоит из мукоидов. Этот слой должен препятствовать диффузии лизосомальных ферментов внутрь фагосом. Поскольку ETZ не существует в микобактерии до фагоцитоза, была поставлена задача увидеть, когда и как она формируется внутри макрофагов. При сравнении динамики образования ETZ в М. leprae и М.aviun, которые оба содержат мукоиды, фагоцитированных макрофагами клеток костного мозга мыши, было установлено, что у М.aviunETZ появились в пределах от 1 до 2 часов после фагоцитоза. Это напоминало образование своего рода«опухоли»тонкого электронного прозрачного слоя клеточной стенки бактерий, которая наблюдалась в участках, где внешний слой полисахарида начинал исчезать. После 3-х часов инкубации этот слой полностью отсутствовал и все бактерии были окутаны густой ETZ. В М. leprae ETZ также формируется в течение одного часа после поглощения макрофагом.
Было также выявлено, что ETZ формируется также быстро в макрофагах, инфицированных инактивированными клетками M. aviumили М. leprae Это показывает, что для образования такой зоны не требуется активного участия бактерий. ETZ значительно уменьшает распространение лизосомальных ферментов на бактерии у обоих видов, причем в М. leprae это оказалось особенно выраженным, поскольку, несмотря на присутствие кислой фосфатазы во многих фагосомах, ни количество бактерий в макрофагах, ни состояние их деградации не изменялись в течение 3,5 месяцев культивирования макрофагов [78].
При проведении количественной оценки частоты проявлення ETZ в разное время после заражения макрофагов бактериями из гладких и прозрачных (smooth transparent (SmT)) колоний M. аviumнаблюдается более выраженная прозрачная зона и большее количество неповрежденных бактерий, чем при фагоцитировании бактерий из гладких куполообразных и непрозрачных (smooth domed-opaque (SmD)). При инфицировании макрофагов инактивированными УФ- или гамма-лучами, H2O2, теплом или глутаральдегидом ETZ была обнаружена у около 50% МБТ, тогда как для живых бактерий этот показатель составил 80-85% В отличие от живых бактерий, для которых процент частоты ETZ оставался стабильными на протяжении инкубационного периода, частота проявления ETZ для убитых бактерий снизилась с течением времени. При проведении сравнительной оценки проявления ETZ на микобактерииях туберкулеза штамма H37 Rv установлено, что несмотря на очень низкую частоту проявления ETZ (8-15%), доля интактных бактерий была идентична уровню с M. аvium, в отличие от трех быстро растущих непатогенных видов (M. smegmatis, М.phlei и М. fallax), которые характеризовались низкой частотой появления ETZ после фагоцитоза и быстрой деградацией. [69]