Файл: Новиков Д.К. Медицинская микробиология.pdf

ческих учреждений, формирование научных медицинских связей с учеными различных республик и зарубежных стран.

Серьезный вклад в развитие бактериологии, вирусологии, инфекционной иммунологии в Республике Беларусь внесли научные школы, созданные ведущими учеными республики Б.Я. Эльбертом и В.И. Вотяковым. Впервые в мире Б.Я. Эльберт и Н.А. Гайский разработали живую туляремийную вакцину и провели широкое испытание ее на людях (1936-1945); Б.Я. Эльбертом предложен новый способ накожного применения живой туляремийной вакцины (1944), что намного упростило ее внедрение в практику.

Ученым Беларуси принадлежит приоритет в комплексной разработке проблем склеромы. Главными итогами проведенных исследований в 1920-30 г. (Б.Я. Эльберт, В.М. Геркес и др.) были предложены схемы классификации и дифференциации капсульных бактерий, изучение антигенной обособленности клебсиеллы склеромы, разработка схемы бактериологической и серологической диагностики склеромы.

Микробиологи Беларуси совместно с клиницистами работали над актуальной проблемой внутрибольничных инфекций и связанных с ней вопросами противомикробных мероприятий. Разработан микробиологический мониторинг за этиологической структурой и лекарственной устойчивостью возбудителей внутрибольничных инфекций, осуществляемый в хирургических и ожоговых отделениях больниц (А.П.

Красильников, А.А. Адарченко, Л.С. Змушко, 1971-1996).

Начиная с 1987 г., в Беларуси ведутся работы по исследованию эпидемиологии и этиологии ВИЧ-инфекции. Белорусским НИИ эпидемиологии и микробиологии в 1989 г. впервые в СССР выделен высокопродуктивный штамм ВИЧ-1 zmb, зарегистрированный в Национальной коллекции вирусов в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского. На основе его были разработаны диагностические препараты для иммуноферментного анализа и иммуноблотинга.

18

II.МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

2.1.Систематика и номенклатура микроорганизмов

Мир микроорганизмов разнообразен и организмы в нем различаются по уровню организации геномов, наличию и составу белоксинтезирующих систем и клеточной стенки. В соответствии с этими признаками микроорганизмы делят на 3 надцарства: эукариоты, прокариоты, вирусы.

Микроорганизмы – это невидимые простым глазом представители всех царств (бактерии, грибы, простейшие, сине-зеленые водоросли, вирусы). Они занимают низшие ступени эволюции, но играют важную роль в существовании и развитии природы, в круговороте веществ, в патологии человека, животных и растений.

Эукариоты имеют дифференцированное ядро, отграниченное от цитоплазмы ядерной мембраной, аппарат митоза и ядрышко. К эукариотам относятся простейшие, дрожжи и нитчатые грибы.

Ядерная ДНК эукариотов находится в комплексе с гистонами в соотношении 1:1, хромосомы построены в виде нуклеосом, состоящих из белковых глобул, и фрагмента ДНК размером в 200 пар нуклеотидов. Эукариоты имеют рибосомы 80S, митохондрии или хлоропласты, не содержат пептидогликана, являются аэробами.

Прокариоты – это организмы, у которых нет оформленного ядра, а есть эквивалент ядра – нуклеоид, который представлен одной или несколькими хромосомами, расположенными в цитоплазме и не отграниченными от нее никакой мембраной. Прокариоты не имеют дифференцированного аппарата митоза, у них нет ядрышка. Они имеют рибосомы 70S, клеточную стенку, содержащую пептидогликан. Размеры прокариотов колеблются от 1 до 20 мкм, у них нет митохондрий и хлоропластов. Среди прокариотов есть аэробные и анаэробные организмы.

К вирусам относят организмы, у которых геном представлен ДНК или РНК, отсутствуют белоксинтезирующие системы, вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

Систематика микроорганизмов занимается подробным описанием видов организмов, выяснением степени родства между ними, объединением их по уровню родства в классификационные единицы – таксоны. Отсюда таксономия – это наука о принципах и методах распределения организмов в иерархическом плане.

Классификация – составная часть систематики, она распределяет микроорганизмы по различным таксонам.

Основной таксономической единицей является вид.

Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение, сходный генотип, среду обитания и свойства, а также способность вызывать сходные процессы в организме человека или внешней среде.

Последующие более крупные таксономические единицы: род, семейство, поря-

док, класс, отдел, царство.

В настоящее время в микробиологии для классификации используется несколько основных способов.

1. Нумерический подход.

19

Он основан на оценке степени сходства и различия организмов по максимально возможному количеству фенотипических свойств и проявлений. Иногда проводят оценку более 100 показателей. Для увеличения достоверности определения признакам присваиваются коэффициенты (их еще называют весом). Чем более важен данный признак для определения возбудителя, чем реже он встречается у других микроорганизмов, тем выше вес признака и тем специфичнее он определяет данного возбудителя (например, продукция плазмокоагулазы у золотистого стафилококка).

2. Генетический подход.

Он основан на сходстве в строении ДНК геномов изучаемых бактерий. Считается, что микроорганизмы, принадлежащие к 1 виду, обладают от 70 до

100% гомологией ДНК. При 60% совпадении речь может идти о принадлежности бактерий к 1 роду.

Для генетической классификации используют метод гибридизации нуклеиновых кислот, изучают процентное содержание гуанина и цитозина в ДНК генома, определяют молекулярный вес ДНК, наличие плазмид. В последнее время, особенно для внутривидовой дифференциации микроорганизмов, используют метод полимеразной цепной реакции.

3. Типирование по рибосомальной РНК (риботипирование).

Оказалось, что рибосомальная РНК бактерий содержит высококонсервативные последовательности, которые в процессе эволюции изменялись незначительно. Различия в структуре рибосомальной РНК позволяют дифференцировать крупные таксоны (порядки, классы, семейства) у бактерий.

Генетические механизмы, лежащие в основе изменчивости микроорганизмов, обеспечивают только относительную стабильность признаков, которые в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложилось понятие о вариантах (типах) микроорганизмов, отличающихся отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают: морфологические (морфовары), биологические (биовары), ферментативные (ферментовары), различные по резистентности к антибиотикам (резистенсвары) и бактериофагам (фаговары) варианты бактерий. Наряду с этим отдельные виды могут включать варианты, различающиеся по антигенной структуре (серовары), экологическим нишам, в которых они обитают (эковары) и патогенности для определенных хозяев (патовары).

Штаммом называют культуру одного вида микроорганизмов, выделенную из различных источников (организма человека, животного, окружающей среды) или из одного и того же источника, но в разное время. Обычно штаммы обозначают прото-

кольными номерами или называют либо по источнику выделения (водный, кишечный), либо по местности, где он был выделен. Штаммы микробов одного вида могут быть совершенно идентичными или различаться по степени вирулентности, метаболической активности, чувствительности к антибиотикам и антисептикам, однако свойства отдельных штаммов не выходят за пределы данного вида микроорганизмов.

Согласно биноминальной номенклатуре каждый микроорганизм имеет название, состоящее из двух слов: первое слово означает род и пишется с прописной буквы, второе слово означает вид и пишется со строчной буквы, например Escherichia coli. Возможно сокращение рода до первой буквы, реже встречаются сокращения до

20

первых двух или трех букв. Достаточно часто используют только родовое название, имея в виду все виды данного рода, или то, что идентификация проводилась только до рода. Вместо видового названия в этом случае используют сокращение: spp.

Клон – культура микроорганизмов, полученная из одной особи.

Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида, выращенные на питательной среде.

Особенности микроорганизмов определили набор признаков и свойств, которые используются в систематике и классификации:

1.Морфологические – величина, форма, взаимное расположение.

2.Тинкториальные – способность окрашиваться различными красителями при сложных методах окрашивания. Одним из наиболе важных признаков является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического строения клеточной стенки. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные.

3.Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких и плотных питательных средах.

4. Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии разделяются на ползающие и плавающие, у которых подвижность связана с наличием жгутиков.

5.Физиологические свойства – способы питания, дыхания.

6.Биохимические свойства – способность расщеплять белки, углеводы, жиры до конечных продуктов обмена.

7.Чувствительность к специфическим бактериофагам.

8.Антигенные свойства (выявляют в иммунологических реакциях).

9.Липидный, белковый и углеводный состав. Белковые спектры определяют с помощью метода двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, где разделяют смеси рибосомных, мембранных и внутриклеточных белков, получая белковые спектры соответствующей фракции определенного вида бактерий. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии.

10.Генетические свойства. Их изучают, используя методы геносистемати-

ки. Наиболее точным методом установления генетического родства является определение степени сходства ДНК.

Молекулярно-биологические признаки основываются на гомологии эталонной и исследуемой ДНК, о которой судят по процентному содержанию гуанин-цитозин (Г+Ц)-пар или по степени гибридизации этих молекул. Химическими методами после гидролиза ДНК и разделения свободных оснований можно узнать нуклеотидный состав. Наиболее часто используется определение точки плавления ДНК, при которой происходит ее денатурация в результате разрыва водородных связей, соединяющих две цепи. Разделение цепей сопровождается заметным увеличением оптической плотности при 260 нм. Если она достигает 90% и выше, говорят о близком генетическом родстве эталонной ДНК с выделенной из исследуемого микроба. Содержание Г+Ц в ДНК можно измерить также путем центрифугирования образца ДНК в градиенте хлорида цезия. ДНК. Наибольшее разнообразие в содержании Г+Ц наблюдается в группе прокариотов, у которых эта величина колеблется от 30 до 75%, но среднее содержание

21

Г+Ц у многих различных штаммов микроорганизмов одного вида очень близко или идентично. В то же время два организма с одинаковым средним нуклеотидным составом ДНК могут резко различаться в генетическом отношении.

Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволяет точно оценить генетическую гомологию штаммов. При быстром охлаждении раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации, ее одиночные цепи остаются разделенными. Однако при температуре на 10-300С ниже точки плавления происходит специфическая реассоциация («отжиг») комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул. Может быть проведена аналогичная реассоциация между молекулами ДНК и РНК, реассоциация «ДНК-рибосомальная РНК» представляет таксономический интерес.

Обычно при гибридизации нуклеиновых кислот используют образцы ДНК с радиоактивной меткой. На этом признаке основан метод молекулярных зондов, применяемый с диагностическими целями. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после этого определяется степень его гомологии с исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить наличие в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить микробиологический диагноз заболевания.

В таксономии микроорганизмов международное признание получил определитель бактерий, изданный Д. Берги (1923 г.), который впоследствии неоднократно переиздавался.

Определитель выделяет грамположительные и грамотрицательные бактерии; эубактерии, лишенные клеточной стенки (микоплазмы); архебактерии (метан- и сульфатредуцирующие архебактерии, галофильные и термофильные архебактерии и архебактерии, лишенные клеточной стенки).

Прокариоты включают царства Eubacteria и Archaebacteria. В них входят отде-

лы.

Отдел I. Gracilicutes, к нему относятся грамотрицательные бактерии. Отдел II. Firmicutes, к нему относятся грамположительные бактерии.

Отдел III. Tenericutes – организмы, не имеющие клеточной стенки (сюда относятся микоплазмы).

Отдел IV. Mendosicutes – бактерии, у которых в клеточной стенке нет пептидогликана.

Для удобства использования определителя описание отделов дается по группам. Патогенные для человека бактерии входят в достаточно небольшое число групп. Группа 1. Спирохеты. Включает свободноживущие и паразитические виды; для

человека патогенными являются представители родов Treponema, Borrelia и Leptospira.

Группа 2. Аэробные и микроаэрофильные подвижные извитые и изогнутые грам(-) бактерии. Патогенные для человека виды входят в роды Campylobacter, Helicobacter и Spirillum.

Группа 3. Неподвижные (редко подвижные) грамотрицательные бактерии (не содержит патогенные виды).

Группа 4. Грамотрицательные аэробные и микроаэрофильные палочки и кокки. Патогенные для человека виды включены в состав семейств Legionellaceae,

22