Файл: Лысак Микробиология.pdf

На чашках с фагом Т1 могут расти только фагоустойчивые клетки. Принцип флуктуационного теста таков: если устойчивые мутанты возникают при контакте с фагом (изменчивость адаптивная), то каждая культура независимо из какой порции она была взята должна содержать приблизительно одинаковое количество устойчивых клеток. Если устойчивые бактерии возникли спонтанно до обработки фагом, то результаты анализа независимых культур (100 штук) будут отличаться от результатов, полученных при анализе образцов, из одной и той же культуры.

Многочисленные опыты свидетельствуют о том, что независимые культуры действительно обнаруживают значительно более резкие колебания (флуктуации) в содержании устойчивых клеток (0, 103, 62, 3, 159 и т.д.), чем пробы, взятые из одной и той же культуры (142, 140, 155, 146, 110 и т.д.). Эти данные подтверждают гипотезу спонтанной мутации.

В 1949 году ученый Г.Ньюкомб поставил новый эксперимент также с фагом Т1 и бактериями E.coli, который в последствии получил название перераспределительного теста. Ньюкомб Г. засевал ряд чашек Петри с питательной средой культурой E.coli, чувствительной к фагу Т1. Засевал так, чтобы был сплошной рост. Засеянные чашки инкубировал при оптимальных условиях (37 ºС) в течение 5 часов. За это время из отдельных клеток сформировались микроколонии. После этого в половину чашек Петри вносил по 0,1 мл физиологического раствора и с помощью микробиологического шпателя перераспределял клетки на поверхности среды. Остальные чашки оставались нетронутыми (контроль). На все чашки с помощью пульверизатора Г.Ньюкомб наносил суспензию фага Т1. Чашки повторно помещал в термостат. После инкубирования подсчитывал число колоний, развившихся из выживших устойчивых клеток.

Принцип теста: если устойчивые клетки возникли благодаря спонтанной мутации до контакта с фагом, то на чашках, где бактерии были перераспределены, должно быть больше устойчивых колоний, чем на контрольных чашках, так как каждая клетка из микроколонии устойчивых бактерий после перераспределения сформирует колонию устойчивую к фагу Т1 (рис. 55).

Именно это и было обнаружено в опыте. Таким образом, из данных, полученных Г.Ньюкомбом следует, что фагоустойчивые мутанты возникли до обработки фагом в результате спонтанной мутации. Фаг в данном опыте действует лишь как селективный агент, позволяющий

169

выявить очень небольшое количество фагоустойчивых мутантов, присутствующих в популяции.

Контроль

добавляют по 0,1 мл физиологического раствора и с помощью шпателя перераспределяют клетки

наносят по 0,1 мл фага Т1 инкубируют и подсчитывают количество колоний устойчивых к фагу Т1

Рис. 55. Перераспределительный тест Г.Ньюкомба

Таким образом, флуктуационный и перераспределительный тесты доказывают, что мутации у микроорганизмов возникают ненаправленно, до воздействия селектирующего агента (фага Т1).

В 1952 году супруги Е. и Дж. Ледерберг предложили непрямой отбор мутантов методом реплик или отпечатков. Этот метод осуществляется при помощи стерильных кусочков бархата с коротким, жестким и густым ворсом. Бархат помещают на столик для реплик (деревянный или металлический цилиндр) и плотно закрепляют металлическим кольцом, так чтобы поверхность была без морщин. Чашки Петри с питательной средой, на которой сформировались колонии микроорганизмов, накладывают поверхностью среды на бархат и слегка прижимают. Чашку осторожно снимают. Ткань с отпечатками колоний после этого может служить исходным штампом для засева методом реплик других чашек со средой. С одного штампа можно снять отпечаток на серию чашек, содержащих различные агаризованные среды.

Ледерберги проделали следующий опыт. Выращивали чистую культуру фагочувствительных бактерий E.coli в бульоне без фага, до концентрации 1.108 кл/мл. Высевали ее на поверхность питательной среды в чашке Петри для образования сплошного роста. После того как бактерии выросли, т.е. сформировался сплошной газон на чашке, при помощи метода реплик, был произведен пересев бактерий парал-

170

лельно на две чашки – одна с обычной средой; другая предварительно засеянная фагом. Чашки помещали в термостат для инкубирования бактерий. На чашке, засеянной фагом, сформировались отдельные фагоустойчивые колонии. Затем чашки 1 и 2 совмещались и из чашки с обычным агаром производили пересев в бульон участка, соответствующего ареалу фагоустойчивых колоний в чашке с фагом. Размножившиеся клетки распределяли по питательной среде в новой чашке и после инкубации переносили с помощью стерильного бархатного штампа в две чашки (с обычной средой и со средой, засеянной фагом) (рис. 56).

Бульонная культура E.coli чувствительная к фагу

Высев на чашку для образования сплошного роста

без фага

с фагом

совмещают чашки и производят пересев с чашки без фага участка, соответствовавшего ареалу фагоустойчивых колоний на чашке с фагом

с фагом

без фага

Рис. 56. Непрямой отбор мутантов методом реплик

Такую процедуру повторяли много раз, и в конце концов была получена суспензия фагоустойчивых мутантов, никогда не имевших контакта с фагом. Этот эксперимент также доказывает мутационную природу изменчивости у бактерий.

171

Мутационная изменчивость относится к генотипической или наследственной изменчивости, т.к. при этом возникают изменения в генетическом аппарате бактерий, которые передаются по наследству.

Кроме генотипической или мутационной изменчивости существует модификационная изменчивость, которая возникает в ответ на изменение условий окружающей среды и наблюдается до тех пор, пока действует фактор, вызывающий эти изменения. Модификационная изменчивость – это изменения на уровне фенотипа, не затрагивающие генотип. Поэтому ее называют еще фенотипической изменчивостью. Фенотипическая изменчивость проявляется у подавляющего большинства особей в популяции, в то время как при мутационной изменчивости происходит изменение генотипа только у единичных клеток.

Существует несколько типов модификационных изменений. Наиболее известны адаптивные модификации, т.е. ненаследственные изменения, полезные для организма и способствующие его выживанию в изменившихся условиях. Примером адаптивной модификации может служить адаптация клеток бактерий E.coli к лактозе как новому субстрату. В этих условиях начинают синтезироваться индуцибельные ферменты, т.е. происходит фенотипическое проявление генов «молчащих» в условиях отсутствия лактозы в среде.

У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН и др.). Адаптивная реакция в данном случае проявляется в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков. Эти белки получили название белков теплового шока, а само явление получило название синдром теплового шока. При стрессовых воздействиях на бактериальную клетку в ней ингибируется синтез обычных белков, но индуцируется синтез небольшой группы белков, функция которых заключается в противодействии стрессовому воздействию путем защиты важнейших клеточных структур, в первую очередь нуклеоида и мембран.

Таким образом, адаптивные модификации расширяют возможности организма к выживанию и размножению в более широком диапазоне условий внешней среды.

Но не все модификации обязательно адаптивны. При интенсивном действии многих агентов наблюдаются ненаследуемые изменения, случайные по отношению к вызвавшему их воздействию. Причины появления таких фенотипически измененных клеток связаны с ошибками процесса трансляции, вызванными этими агентами.

172

Возникающие модификации могут быть относительно стабильными или, наоборот, очень лабильными. Иногда они могут сохраняться в течение нескольких поколений.

7.2.Классификация бактериальных мутаций. Молекулярные механизмы мутационного процесса. Мутагенные факторы

Мутация – изменения, возникающие в генетическом аппарате и передающиеся по наследству.

Мутации бывают спонтанные и индуцированные. Мутации, возникающие в популяции бактерий без экспериментального вмешательства называют спонтанными. Как правило, спонтанные мутации можно объяснить случайными ошибками при репликации ДНК. Например, тимин, который обычно спаривается с аденином, может перейти в енольную форму и образовать водородные связи с гуанином. В результате в новой молекуле ДНК на том месте, где раньше находилась пара Т-А, появляется пара Г-Ц. Возникают такие мутации довольно редко. В среднем частота спонтанных мутаций составляет 10-4 – 10-10, т.е. измененной оказывается одна клетка на 104 – 1010 клеток.

Индуцированная мутация возникает с помощью воздействия тех или иных факторов – мутагенных агентов, которые существенно повышают частоту мутаций. Мутагенами могут быть химические, физические и биологические агенты. К ним относятся УФ-лучи, ионизирующие излучения, азотистая кислота, нитрозогуанидин, аналоги азотистых оснований, некоторые антибиотики, акридиновые красители, сернистый иприт, транспозоны, IS-элементы, бактериофаг µu и др.

Все мутагены действуют на генетический аппарат бактерий, т.е. на ДНК. Мутагенные агенты не характеризуются специфичностью, т.е. нельзя используя какой-то мутаген выделить только определенный тип мутаций. Мутагены способны только повышать частоту мутаций.

Мутации по фенотипическим последствиям подразделяют на прямые и обратные или реверсии.

Мутации, приводящие к утрате или изменению какой-то функции клетки, относятся к классу прямых мутаций, так как они вызывают появление ненормального фенотипа, который отличается от дикого типа. Другими словами прямые мутации это мутации от дикого типа к мутантному. Например, бактерии E.coli способны сбраживать лактозу ( Lac+ - фенотип) и поэтому мутация Lac+ Lac- будет прямой.

173

Врезультате обратной мутации восстанавливается у мутантного

организма дикий фенотип:

Lac- Lac+ – обратная мутация или реверсия.

Обратные мутации бывают истинными (истинные реверсии) и вторичными. Об истинных обратных мутациях говорят лишь в тех случаях, когда вторая мутация восстанавливает исходный генотип, т.е. когда измененный при первой мутации триплет нуклеотидов будет вновь кодировать ту же аминокислоту, что и раньше. Например, если пара Т-А заменена парой Г-Ц, другая мутация, восстановившая пару Т-А, восстановит и последовательность дикого типа. Однако эффект первой мутации может быть компенсирован мутацией в другой части гена. Такие мутации называют вторичными реверсиями. Иногда возникают также мутации в других соседних генах, которые помогают каким-то образом обойти эффект первой мутации. Их называют супрессорными мутациями. Супрессорные мутации восстанавливают у мутанта только дикий фенотип, не восстанавливая первоначального состояния самого мутантного гена.

По фенотипическим проявлениям (характер измененного признака) мутации подразделяют на:

1) морфологические мутации – когда в результате мутации изменяется какой-то морфологический признак (капсульные бескапсульные, утрата жгутиков, изменение морфологии колоний и др.);

2) биохимические мутации:

-ауксотрофные мутанты (нуждающиеся в дополнительных факторах роста);

-мутанты, устойчивые к ингибиторам, антибиотикам, бактериоцинам, ядам или бактериофагам;

-мутанты, чувствительные к температуре (условно-летальные);

-мутанты, не способные использовать определенный субстрат (Lac+ Lac-) или иначе с измененной способностью к сбраживанию;

-мутанты с конститутивным синтезом катаболических ферментов (т.е. с нарушенной регуляцией);

-мутанты с конститутивным синтезом анаболических ферментов;

-мутанты по вирулентности;

-мутанты с измененными антигенными свойствами.

Вотношении изменений генетической структуры (изменений в первичной структуре ДНК) различают следующие типы мутаций: делеции, точковые мутации, мутации со сдвигом рамки.

174