Файл: Лысак Микробиология.pdf

Делеция – выпадение участка ДНК, т.е. эта мутация захватывает группу смежных генов. Такие мутации необратимы и получить ревертанты невозможно.

Точковая мутация – мутация, затрагивающая только одну пару оснований, т.е. одна пара оснований заменяется на другую. Например, вместо А - Т может быть Г - Ц или наоборот. Для точковых мутаций характерна высокая частота реверсии. Точковые мутации могут быть двух типов:

-транзиции – замена пурина на другой пурин или пиримидина на другой пиримидин (простая замена). Например, пара Г - Ц может быть заменена на А - Т или наоборот. Это наиболее часто встречающийся класс точковых мутаций.

-трансверсии – замена пурина пиримидином и наоборот (сложная замена), т.е. пара А - Т превращается в Т - А или Г - Ц.

Мутации с заменой оснований часто оказываются миссенсмутациями (мутациями с изменением смысла), в которых последовательности кодирующего триплета оснований после замены кодирует уже другую аминокислоту. Значительная часть мутаций с заменой оснований представляет собой нонсенс-мутации (бессмысленные мутации), характеризующиеся тем, что кодирующий какую-либо аминокислоту триплет превращается в триплет, не кодирующий никакой аминокислоты.

Под влиянием некоторых мутагенов могут происходить вставки или выпадения оснований. Такие мутации называются мутациями со сдвигом рамки считывания. Если в молекулу ДНК при репликации включается или утрачивается из нее основание, то это приводит к сдвигу рамки при считывании закодированной информации и как следствие – изменение последовательности аминокислот в белке мутантного штамма. Ревертанты в данном случае получить трудно.

Рассмотрим механизмы действия некоторых мутагенов:

Азотистая кислота (HNO2) дезаминирует (отщепляет NH2 и замещает другой группой) аденин, гуанин или цитозин, что приводит к ошибкам при репликации ДНК. В частности в результате замещения аминогруппы гидроксильной группой аденин превращается в гипоксантин, который похож на гуанин. При репликации ДНК гипоксантин спаривается с цитозином вместо тимина, что приводит к мутации АТ – ЦГ. Таким образом, происходит простая замена оснований или транзиция. Если HNO2 взаимодействует с цитозином, то он дезаминирует-

175

ся в урацил и при репликации образует пару с аденином вместо гуанина, и это ведет к мутации ГЦ – АТ (транзиция).

Гидроксиламин вступает в реакцию главным образом с цитозином и изменяет его так, что тот при репликации спаривается с аденином вместо гуанина. Происходит мутация ЦГ – АТ (транзиция).

Аналоги азотистых оснований или антиметаболиты очень сходны по строению с нормальными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями и поглощаясь клетками включаются в ДНК. В молекуле ДНК они могут находится в двух таутомерных формах (за счет перераспределения в их структуре электронов и протонов) – обычной кето-, или аминоформе, и реже встречающейся енольной, или иминоформе. Переход в другую таутомерную форму может привести к неправильному образованию пар во время репликации ДНК, возникает ошибка репликации.

Чаще всего для выделения мутантов используют 5-бромурацил и 2-аминопурин.

5-бромурацил представляет собой соединение, сходное по строению с тимином:

Поэтому он может включаться вместо тимина в цепь ДНК как партнер аденина.

АТ

ГЦ

ГЦ

Т А

АБУ

1 – родительская цепь,

2 – дочерняя цепь (после репликации).

При переходе 5-бромурацила в енольную форму (БУ*) он спаривается при репликации ДНК как цитозин, т.е. вызывает включение гуанина вместо аденина.

176

БУ А

ТА

ЦГ

ЦГ

АТ

БУ* Г

После третьей репликации получается вместо пары АТ пара ГЦ (трансзиция АТ – ГЦ)

АТ

АТ

ГЦ

ГЦ

Т А

ГЦ

2-аминопурин по структуре напоминает аденин. Поэтому он может замещать аденин в молекуле ДНК. Как и аденин, 2-аминопурин обычно спаривается с тимином, но при переходе в енольную форму может соединяться с цитозином, что приводит к изменению пар оснований в потомстве.

Алкилирующие агенты – нитрозогуанидин, диэтилсульфат, метилметансульфат, этилметансульфонат, сернистый иприт и др. – принадлежат к наиболее эффективным мутагенам. Они модифицируют (алкилируют) в репликативной вилке преимущественно пуриновые основания, в первую очередь гуанин, вызывая его спаривание с тимином, вместо цитозина. Возникают главным образом транзиции типа ГЦ –ТА.

Акридиновые красители (акридиновый оранжевый, акрифлавин, трипофлавин). Молекулы акридиновых красителей внедряются между соседними азотистыми основаниями в цепи ДНК и увеличивают расстояние между ними. Такое пространственное изменение при репликации ДНК может вызывать ошибки двух типов – утрату нуклеотида или включение дополнительной пары нуклеотидов. Мутации этого

177

типа приводят к очень серьезным последствиям так как при этом нарушается порядок считывания белка: начиная с места утраты или включения нуклеотида, информация считывается в «неправильных» триплетах (мутация «со сдвигом рамки»).

УФ-лучи поражают тиминовые основания, образуются димеры тимина в ДНК. Наличие таких димеров тимина служит источником ошибок при репликации ДНК. УФ-лучи вызывают транзиции, трансверсии и делеции.

Перемещающиеся (мобильные, мигрирующие) генетические элементы бактерий – это дискретные сегменты ДНК, способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах репликона, а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного или фагового) в другой. К таким элементам относятся простые вставочные последовательности (IS-элементы), транспозоны (Tn-элементы) и фаги-транспозоны (µu, Д3112 и др.). Интеграция их в репликоны осуществляется независимо от системы общей рекомбинации клеток, которая требует гомологии у рекомбинирующих структур.

IS-элементы – представляют собой линейные фрагменты двухцепочечной ДНК длиной от 200 до 2000 п.о. Они содержат в своем составе только гены, кодирующие синтез фермента транспозазы, необходимого для их перемещения или транспозиции. По концам ISэлементов расположены инвертированные повторы (ITR) (инвертированный – перевернутый. Расположение нуклеотидов на разных концах перевернутое или противоположно ориентированное). У разных ISэлементов длина концевых повторов варьирует от 8 до 40 п.о. Инвертированные повторы также принимают участие в транспозиции. Схематично строение IS-элемента можно изобразить следующим образом:

ГТТЦАГА ГЦТГААЦ

ITR

ITR

концевые инвертированные повторы (ITR)

Различают несколько типов IS-элементов: IS1, IS2, IS3, IS4 и др. Они отличаются друг от друга своей длиной (количеством пар оснований) и различиями в концевых повторах ITR.

IS-элементы являются нормальными компонентами бактериальных хромосом и плазмид. В разных репликонах может содержаться раз-

178

личное число копий IS-элементов. Например, в F-факторе, который отвечает за донорные свойства бактерий, имеется одна копия IS2- и 2 копии IS3элементов.

IS-элементы могут перемещаться из одного участка генома в другой, в частности из бактериальной хромосомы в плазмиду и обратно, от плазмиды к плазмиде; таким образом они могут включаться в различные участки генома. При перемещениях они могут встраиваться в пределах одного гена и инактивируют его или изменяют его регуляцию.

Транспозоны – сложные перемещающиеся элементы. От ISэлементов они отличаются тем, что кроме генов, ответственных за транспозицию, содержат структурные гены, определяющие функции, не имеющие отношение к процессу транспозиции, т.е. отвечающие за какой-то фенотип. Транспозоны могут контролировать резистентность к антибиотикам и ионам тяжелых металлов, способность к катаболизму лактозы, раффинозы или толуола, синтез энтеротоксина (табл. 8). В связи с этим их легче обнаружить, чем IS-элементы. Длина транспозонов свыше 2000 п.н. Транспозоны как и IS-элементы имеют концевые повторы (ITR). Часто ими служат IS-элементы. Поскольку ISэлементы сами заканчиваются ITR, то любой транспозон всегда имеет на концах инвертированные повторы.

Таблица 8

Фенотипические признаки, детерминируемые некоторыми транспозонами

Примечание: Ap – устойчивость к ампициллину, Sm – устойчивость к стрептомицину, Su – устойчивость к сульфаниламидам, Hg – устойчивость к ионам ртути, Km – устойчивость к канамицину, Nm – устойчивость к неомицину, Tp – устойчивость к триметоприму, Cm – устойчивость к хлорамфениколу, Tc – устой-

179

чивость к тетрациклину, Lac – сбраживание лактозы, Ent – синтез энтеротоксина, Gm – устойчивость к гентамицину, Cb – устойчивость к карбенициллину.

В зависимости от того, чем ограничен на концах транспозон можно выделить несколько групп транспозонов:

1. Транспозоны, фланкированные (ограниченные) двумя IS1-эле- ментами. Такие транспозоны подразделяют на 2 подгруппы: а) IS1-элементы на концах транспозона находятся в прямой ориентации. Поскольку каждый IS1-элемент в свою очередь ограничен короткими инвертированными последовательностями (ITR), то на концах целого транспозона оказываются противоположно ориентированные ITRповторы. Так построен транспозон Tn 9:

б) IS1-элементы находятся на концах транспозона в противоположной ориентации. Представителем этой группы является Tn 1681:

2.Транспозоны, фланкированные другими IS-элементами в прямой ориентации. Примером таких транспозонов является Tn 2680.

3.Транспозоны, фланкированные длинными инвертированными повторами не идентичными известным IS-элементам. К этой группе относится Tn 5.

Транспозоны различают по степени специфичности при выборе мест интегрирования в репликоны. Различают высокую, региональную, среднюю, низкую специфичность. При высокой специфичности транспозон интегрируется только в один или несколько сайтов. Таким является транспозон Tn7. При региональной специфичности транспозон интегрируется преимущественно в некоторые районы, внутри которых интеграция происходит в многочисленные сайты. Это характерно для транспозона Tn1. Когда вставки транспозона осуществляются во многие участки, но имеются предпочтительные сайты, говорят о средней специфичности (Tn 9 и Tn 10). При низкой специфичности почти каждый акт транспозиции осуществляется в новый сайт (Tn5). Однако, следует отметить, что специфичность транспозиции

180