Файл: 004 lec bio.pdf

Механизмы переноса бактериальной ДНК

Конъюгация (А), трансформация с использованием отдельной молекулы ДНК (Б), трансдукция с помощью фагов

(В).

41

Получение

продуцентов

42

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ СЕЛЕКЦИИ

Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК.

Основные этапы селекции

•Получение мутантов

•Отбор мутантов:

а) Отбор случайных (непредсказуемых) мутаций по количественному признаку;

б) Отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным фенотипом.

Фенотип – совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития.

43

Селекция на устойчивость к структурному аналогу целевого продукта

Основа метода: отбор клонов с нарушенной негативной регуляцией собственного биосинтеза

E1 E2 E3

A → B → Lys → C

Если в клетке в результате мутации ферменты, участвующие в биосинтезе, станут нечувствительны к негативной регуляции лизином, эта клетка может стать сверхпродуцентом

Селективная среда

На среде с AEC вырастают только клетки, в которых нарушена негативная регуляция лизином, и поэтому они не чувствительныи к AEC.

Интактные клетки на этой среде не делятся, так как у них заблокирован биосинтез лизина

AE

Использование селективной средыпозволяет снизить количество исследуемых клонов до десятков

45

Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности)

Две возможности конструирования сверхпродуцентов

АУКСОТРОФНЫЕ (БИОХИМИЧЕСКИЕ) МУТАНТЫ -- мутанты бактерий с дополнительными питательными потребностями из-за потери способности синтезировать те или иные вещества вследствие повреждения генов.

47

Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности)

Селекция в два этапа:

•После мутагенеза клетки высевают на полной среде

•Клетки всех клонов высевают на среде без вещества Х

Те клоны, которые не размножаются на этой среде -- ауксотрофы по Х, следовательно могут продуцировать Lys в больших количествах

48

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Ограничения использования метода селекции:

•1) нельзя скрещивать неродственные виды;

•2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;

•3) нельзя предугадать, какое получится потомство.

49

Возможности генной инженерии

1.Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции. В основе рекомбинации гетерологичных ДНК in vitro лежит прием, позволяющий с помощью рестриктаз подготовить молекулы для скрещивания, то есть разрезать разные ДНК с образованием одинаковых липких концов.

2.Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен “запрещающими” механизмами организма.

3.Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).

50

Технология рекомбинантных ДНК (рДНК)

Этапы генетического конструирования in vitro:

1. Получение нужного гена (выделение нужных генов из ДНК, химико-

ферментативный синтез, ферментативный синтез гена на основе выделенной мРНК);

2.Встраивание полученного гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор), например, получение рекомбинантной плазмиды;

3.Введение гена в составе вектора (например, рекомбинантной плазмиды) в организм-реципиент, например в клетки E.coli (конъюгация, трансформация, трансдукция);

4.Клонирование в E.coli фрагмента ДНК;

5.Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены.

6.Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип.

51

Ферменты, позволяющие получать рекомбинантные молекулы ДНК

Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять (гидролизовать) ДНК в строго определенном месте, называются рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами.

схема действия фермента рестриктазы EcoRI

схема действия фермента рестриктазы SmaI

52

Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности

Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент -- ДНК-лигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными