Файл: М1Т02.фарбування за грамом для викладачів.doc

Навчальна дисципліна	“МІКРОБІОЛОГІЯ, ВІРУСОЛОГІЯ ТА ІМУНОЛОГІЯ”
Модуль № 1	Морфологія і фізіологія мікроорганізмів. Інфекція. Імунітет.
Змістовний модуль № 2	Морфологія і структура прокаріотів та паразитичних одноклітинних еукаріотів. Фарбування мікроорганізмів. Мікроскопія.
Тема заняття	Фарбування бактерій за Грамом.
Курс	2-й
Факультет	Медичний

М Методичні рекомендації склала:

ас. Андрюшкова Наталя Григорівна.

Київ – 2008

Конкретні цілі:

Засвоїти техніку фарбування за Грамом, використовуючи культури грампозитивних та грамнегативних бактерій.
Вивчити властивості грампозитивних та грамнегативних бактерій.

2. Базовий рівень підготовки.

Назви попередніх дисциплін	Отримані навики
Анатомія людини	Аналізувати інформацію про будову тіла людини, системи, що його складають, органи і тканини
Гістологія, цитологія, ембріологія	Інтерпретувати мікроскопічну та субмікроскопічну структуру клітин
Медична і біологічна фізика	Трактувати загальні фізичні та біофізичні закономірності, що лежать в основі біологічних процесів.
Медична біологія	Пояснювати на молекулярно-біологічному та клітинному рівні закономірності біологічних процесів
Медична хімія	Трактувати загальні фізико-хімічні закономірності, що лежать в основі процесів розвитку клітин

Організація змісту навчального матеріалу.

3.1. Зміст теми.

На практичному занятті студенти вивчають принципи складних методів фарбування препаратів, техніку фарбування за Грамом, готують мазки із чистих культур стафілокока та кишкової палички, фарбують мазки за методом Грама, мікроскопічно вивчають виготовлені препарати-мазки із використанням імерсійного об’єктиву, вивчають властивості грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

. Теоретичні питання до заняття:

Складні методи фарбування бактерій.
Метод Грама.
Механізм фарбування за Грамом.
Техніка фарбування за Грамом.
Властивості грампозитивних та грамнегативних бактерій.
Тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів.

. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

Вивчити властивості грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів.
Вивчити тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів.
Вивчити сучасні теорії, що пояснюють механізми фарбування за Грамом.
Вивчити особливості хімічного складу клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій.
Приготувати препарати-мазки з чистих культур стафілококута кишкової палички, зафарбувати за методом Грама, мікроскопічно дослідити зафарбовані препарати.

. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент на занятті:

Термін	Визначення
1	2
Складні методи фарбування бактерій	Складні методи дозволяють диференціювати одні мікроорганізми від інших, а також вивчити особливості будови мікробних клітин. До складних методів відносять фарбування по Граму, за Романовським-Гімзою, метод Циля-Нільсена, Нейсера.
Метод Грама	Метод розробив Крістіан Грам у 1884р.Серед складних методів фарбування він є найбільш універсальним. Він має важливе диференційно-діагностичне значення, оскільки допомагає визначити таксономічне положення тих чи інших бактерій
Тинкторіальні властивості бактерій	Здатність та індивідуальна особливість бактерій забарвлюватись тими чи іншими барвниками називають їх тинкторіальними властивостями.
Грампозитивні бактерії	Грампозитивні бактерії забарвлюються за методом Грама в темно-фіолетовий колір (здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом).
Грамнегативні бактерії	Грамнегативні бактерії забарвлюються за методом Грама в червоний колір (сполука з генціанвіолетом та йодом вимивається спиртом, тому вони забарвлюються фуксином в червоний колір).

3.5. Рекомендації для оформлення протоколу. Властивості грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів

ГРАМПОЗИТИВНІ	ГРАМНЕГАТИВНІ
1.Не чутливі до дії пепсину, трипсину, панкреатину.	Перетравлюються ферментами шлунково-кишкового тракту.
2.Чутливі до лізоциму, пеніциліну, йоду.	Мало чутливі.
3.Слабо виражені імунологічні властивості.	Добре виражені імунологічні властивості.
4.Можуть бути кислотостійкими.	Чутливі до дії кислот.
5.Можуть утворювати ендоспори.	Ендоспор не утворюють.
6.Війок не утворюють.	Можуть утворювати війки.
7.Можуть утворювати екзотоксин.	Рідко продукують екзотоксин. При руйнуванні клітин виділяється ендотоксин.

Тинкторіальні властивості деяких мікроорганізмів

ГРАМПОЗИТИВНІ ГРАМНЕГАТИВНІ

1. Стафілокок. 1. Менінгококи.

2. Стрептокок. 2. Гонококи.

3. Коринебактерії дифтерії. 3. Кишкова паличка.

4. Мікобактерії туберкульозу. 4.Сальмонелли.

5. Збудник правця. 5. Шигели.

6. Збудник газової гангрени. 6. Збудник чуми.

7. Збудник ботулізму. 7. Збудник туляремії.

8. Актиноміцети. 8. Холерний вібріон.

СУЧАСНІ ТЕОРІЇ, ЩО ПОЯСНЮЮТЬ МЕХАНІЗМИ ФАРБУВАННЯ ЗА ГРАМОМ

1. Відмінність в кислотності білків цитоплазми у грампозитивних та грамнегативних бактерій.

Ізоелектрична точка білків цитоплазми грампозитивних бактерій знаходиться в межах рН 2-5, у грамнегативних бактерій – в межах рН 5-7. Кислі білки грампозитивних бактерій мають спорідненість до анілінових барвників, утворюють з йодом стійкі до дії спирту комплекси.

2. Особливості нуклеїнового складу бактерій.

У грампозитивних бактерій виявлено велику кількість рибонуклеїнату магнію (співвідношення РНК:ДНК у грампозитивних бактерій дорівнює 8:1, а у грамнегативних бактерій 1:1). Вважають, що рибонуклеїнат магнію утворює великі стійкі комплекси з барвником і йодом, які не вимиває спирт.

3. Особливості хімічного складу та будови клітинної стінки.

Клітинна стінка грампозитивних бактерій містить до 90% глікопептиду (муреїн), містить тейхоєві кислоти. Муреїн багатошаровий.

У грампозитивних бактерій, можливо, проникність клітинної стінки нижча, ніж у грамнегативних бактерій. Комплекс генціанвіолет-йод утримується в стінці після дії спирту, оскільки при цьому зменшується діаметр пор в глікопептиді.

Стінка грамнегативних бактерій містить глікопептиду значно менше, його молекула “зшита” слабкіше порівняно з стінками грампозитивних бактерій. Вважають, що після обробки етиловим спиртом пори в молекулі глікопептиду грамнегативних бактерій залишаються широкими, що дозволяє екстрагувати комплекс генціанвіолет-йод.

Особливості хімічного складу клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій

ГРАМПОЗИТИВНІ ГРАМНЕГАТИВНІ

1. У клітинній стінці мало білків, а пептиди одноманітні за складом амінокислот.	Клітинна стінка містить усі амінокислоти, містить білки.
2. Ліпідів мало.	Ліпідів багато (до 22%).
3. Глікопептидів до 90%.	Глікопептидів мало (5-9%).
4. Містять тейхоєві кислоти.	Тейхоєві кислоти відсутні.