Тема № 24. Біосинтез нуклеїнових кислот: реплікація, транскрипція.

Актуальність теми

Механізми реплікації і транскрипції лежать в основі збереження, передачі і реалізації генетичної інформації. У процесі біосинтезу нуклеїнових кислот можливі різноманітні порушення нуклеотидної послідовності під впливом фізичних (нагрівання, іонізуючі, корпускулярні опромінення), хімічних (мутагени) та біологічних (віруси) факторів. В процесі біосинтезу нуклеїнових кислот можливі різноманітні порушення нуклеотидної послідовності під впливом фізичних (нагрівання, іонізуючі, корпускулярні опромінення), хімічних (мутагени) та біологічних (віруси) факторів. Знання цих механізмів є фундаментальними не лише для майбутніх фармацевтів, а й для будь-якої освіченої людини. У медичній практиці широко використовуються фармацевтичні препарати, що інгібують біосинтез нуклеїнових кислот у прокаріотичних організмах та гальмують поділ клітин пухлин у онкологічних хворих. Крім того, розуміння процесів передачі і реалізації генетичної інформації дозволяє розширити підходи до діагностики, лікування та корекції метаболічних змін, причиною яких є порушення функціонування генетичного апарату клітини

Мета заняття

• уміти пояснювати молекулярні механізми реплікації і транскрипції; характеризувати функціонування відповідних ферментативних систем.

• знати закономірності матричного синтезу нуклеїнових кислот, етапи цих процесів, механізми мутацій, репарацій та виникнення і розвитку спадкових захворювань.

• засвоїти механізм дії антибіотиків та інших інгібіторів синтезу нуклеїнових кислот.

Конкретні завдання:

• Характеризувати механізми реплікації ДНК: основні принципи, ферментативні системи.

• Пояснювати механізми транскрипції РНК: етапи, функціонування ферментів.

• Трактувати молекулярно–біологічні закономірності збереження та передачі генетичної інформації,

• роль ферментних систем, які забезпечують напівконсервативний механізм реплікації ДНК у прокаріот та еукаріот.

• Пояснювати механізми функціонування ферментної системи транскрипції РНК.

• Трактувати механізми регуляції експресії генів на рівні транскрипції оперонів, які включають структурні та регуляторні гени, промотор та оператор.

• Трактувати біохімічні механізми генетичних рекомбінацій, ампліфікації генів, особливості регуляції експресії генів у еукаріотів.

• Оволодіти методом кількісного визначення ДНК в біологічному матеріалі з метою оцінки інтенсивності реплікаційних та біосинтетичних процесів.

• Аналізувати наслідки геномних, хромосомних та генних мутацій, механізми дії найбільш поширених мутагенів, біологічне значення та механізми репарації ДНК (репарація УФ–індукованих генних мутацій).

• Пояснювати механізми дії деяких антибіотиків - інгібіторів транскрипції.

---

Теоретичні питання

1. Біологічне значення реплікації ДНК. Напівконсервативний механізм реплікації; схема експерименту М.Мезелсона та Ф.Сталя.

2. Загальна схема біосинтезу ДНК. Ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

3. Молекулярні механізми реплікації ДНК: топологічні проблеми (топоізомерази, хелікази); значення антипаралельності ланцюгів ДНК; фрагменти Оказакі. Етапи синтезу дочірніх ланцюгів молекул ДНК.

4. Біологічне значення та механізми репарації ДНК. Репарація УФ-індукованих генних мутацій; пігментна ксеродерма.

5. Загальна схема транскрипції; кодуючі та некодуючі ланцюги ДНК. РНК–полімерази прокаріотів та еукаріотів.

6. Етапи та ферменти синтезу РНК. Сигнали транскрипції: промоторні, ініціаторні, термінаторні ділянки генома.

7. Процесинг–посттранскрипційна модифікація РНК.

8. Фармпрепарати – інгібітори матричних синтезів.

9. Мутації: геномні, хромосомні, генні (точкові); роль у виникненні ензимопатії та спадкових хвороб людини.

10. Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів – аналогів азотистих основ, дезамінуючих, алкілуючих агентів, ультрафіолетового та іонізуючого випромінювання.

11. Принципи генної інженерії та клонування генів, їх застосування в сучасній медицині.

12. Ампліфікація генів (гени металотіонеїну, дигідрофолатредуктази).

Практична робота

Дослід № 1. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР).

ПЛР – це високоспецифічний метод експрес–діагностики, що дозволяє множити певні нуклеотидні послідовності до утворення необмеженого числа копій генів в таких кількостях, які можна виявити методом молекулярної гібридизації за допомогою електрофорезу.

Принцип методу. ПЛР базується на багатократному повторюванні циклів синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК–мішені з дезоксинуклеозидтрифосфатів у присутності термостабільної ДНК–полімерази, відповідного сольового буфера та олігонуклеотидних затравок–праймерів, що визначають кордони ампліфікованої ділянки ДНК-мішені. Для діагностики інфекційного захворювання підбираються системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дозволяють ампліфікувати фрагмент, що має для кожної системи праймерів свою довжину.

---

Матеріальне забезпечення: 1) Обладнання: Ампліфікатор; автоматичні мікропіпетки на 10 і 20 мкл; пластикові пробірки на 0,2; 0,5 та 1,5 мл; одноразові наконечники до мікропіпеток; мікроцентрифуга; вортекс; апарат для електрофорезу ДНК в агарозному гелі; джерело постійного електричного струму (V – 50-250В, I – до 50мА); трансілюмінатор з фільтром на 310 нм; ламінарний бокс або бокс для ПЛР; фотоапарат з приставкою для реєстрації результатів ПЛР. 2) Реактиви: Набір для виділення ДНК із біопроб на 100 зразків (зберігають при +4˚С) : розчин І (лізуючий) 30мл, розчин ІІ (промивний) 10 мл, розчин ІІІ (промивний) 200 мл, сорбент 1000 мкл, ТЕ-буфер 5мл.

2. Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки та плазми крові на 100 зразків (зберігають при +4˚С) : денатуруючий розчин – 45 мл, ізопропіловий спирт – 30 мл, промивний розчин – 100 мл, розчин носія – 300 мкл, вода дейонізована – 3 мл, хлороформ – 12 мл.

3. Набір для проведення ПЛР на 110 визначень (зберігати при температурі – 20˚С): реакційна суміш 300 мкл, Тад-полімераза (5 од/мкл) 25 мкл, вода дейонізована –2 мл, масло вазилінове – 2 мл, ДНК контрольна – 50 мкл. Реактив – термостабільну ДНК–полімеразу отримують із спеціального штама Bac. termophilis , сконструйованого методами генної інженерії.

4. Набір для приготування реакційної суміші, до складу якої входять: розчин ДНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфати), розчин специфічних праймерів, ПЛР-буфер, барвник. Основним реактивом тут є праймери– специфічні для кожного виду ділянки ДНК; їх отримують хімічним синтезом з відповідною послідовністю для даного виду, що складає 20-30 нуклеотидів. Праймери патентуються і строго зберігаються.

Набори призначені для виявлення invitro ДНК збудників інфекційних захворювань у біологічних зразках методом ПЛР з праймерами, специфічними до фрагментів геномів цього збудника і можуть бути використані для діагностики і контролю за специфічною терапією певної інфекції, а також бацилоносійства.

Хід роботи:

1. підготовка клінічних зразків (біоптати тканин, крапля крові, сперма, слиз жіночих статевих органів, осад сечі, волосся людини, зішкреби епітеліальних клітин тощо);

2. виділення ДНК зі зразків (ДНК–матриці генів клітин, вірусів і бактерій більш стійкі, ніж РНК, і тому вони придатні для ПЛР після тривалого часу);

3. проведення циклів полімеразної ланцюгової реакції (реакції ампліфікації) – кожний цикл складається з трьох стадій з різними температурними режимами.

---

На першій стадії при 94˚С проходить розділення ланцюгів ДНК (денатурація ДНК);

На другій при 50–65˚С – приєднання (відпалювання) праймерів до гомологічних послідовностей на ДНК–мішені;

На третій при температурі 72˚C – синтез нових ланцюгів ДНК, тобто комплементарна добудова ДНК шляхом подовження праймера у напрямку 5’–3’ з участю ДНК–полімерази в присутності іонів магнію.

Фрагмент ДНК –

об’єкт ампліфікації

3

5

Денатурація та відпалювання

праймерів

3

A₁

5

Синтез ДНК

A₂

---

20-30 циклів

Таким чином, у першому циклі ампліфікації синтезуються продукти, які стають матрицями для другого циклу ампліфікації, в результаті якого утворюється досліджуваний фрагмент ДНК – амплікон. Починаючи з третього циклу, амплікони стають матрицями для синтезу нових ланцюгів, тобто у кожному циклі здійснюється подвоєння кількості копій, що дозволяє за 25–40 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою відібраних праймерів, у кількості, якої достатньо для її детекції за допомогою електрофорезу;

4. розділення продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі; виявляють смуги фрагментів ДНК (ампліконів) за допомогою флуоресцентного барвника (хромофора) – бромистого етидія;

5. перенесення геля на скло трансілюмінатора;

6. аналіз результатів при ввімкнутому трансілюмінаторі, а саме виявлення фрагментів аналізованої ДНК у вигляді оранжево-червоних смуг при УФ–випромінюванні з довжиною хвилі 310 нм; кількість апмпліконів визначають за інтенсивністю їх флуоресценції. Отримані результати можна документувати фотографуванням гелів з використанням оранжевого або інтерференційного (594 нм) світлового фільтру.

Значення для фармації та клініки. Мета прикладної генетичної інженерії полягає в конструюванні таких рекомбінантних молекул ДНК, які при впровадженні в генетичний апарат надавали б організму властивості, корисні для людини. Наприклад, отримання «біологічних реакторів» - мікроорганізмів, рослин і тварин, які продукують фармакологічно значущі для людини речовини.

У медицині метод ПЛР застосовується для діагностики інфекцій шляхом ідентифікації патогенних бактерій і вірусів у біологічних матеріалі. З метою діагностики кожної інфекції підбираються специфічні системи праймерів для ПЛР. За допомогою ПЛР одну молекулу ідентифікованої ДНК можна виявити в присутності міліонів інших молекул ДНК. Чутливість реакції 97–99 %. ПЛР широко використовують у ранній діагностиці ВІЛ–інфекції, бацилоносійства, вірусних гепатитів тощо, а також для моніторинга і оцінки специфічної терапії певної інфекції, резистентності та чутливості до антибіотиків.

---

Смотрите также файлы

• БХ Тема23.docx

• БХ Тема22.docx

• БХ Тема21.docx

• БХ Тема 8.docx

• БХ Тема 7.docx