ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 17.07.2019
Просмотров: 1206
Скачиваний: 4
І. ВІДБІР МІКРООРГАНІЗМІВ – ПРОДУЦЕНТІВ.
Основою сучасного біотехнологічного виробництва є мікробіологічний синтез, головною ланкою якого є клітина.
Клітина (за Овчинниковим Ю.А.) це мініатюрний хімічний завод, який працює з колосальною віддачею узгоджено та за програмою. Що хвилини у ній синтезується сотні складних сполук, в першу чергу білків.
Мікроорганізми – бактерії, дріжджі, міцеліальні гриби є складовою частиною таких біотехнологічних процесів як біосинтез антибіотиків, ферментів, амінокислот, інтерферонів, гормонів.
Незалежно від природи об’єкту, початковим етапом біотехнологічної розробки є отримання чистих культур клітин та тканин. На сьогодні відомо більше ніж 100 тис. різних видів мікроорганізмів.
Як же провести відбір форм, продукція яких нас цікавить? Як відібрати продуцентів вітаміну В12, треоніну, еритроміцину, холестериноксидази або метану?
Проводять відбір мікроорганізмів.
Перший шлях. Відбирають зразки з місцевості, де вірогідність продуцента найбільша. Наприклад, вуглевод окислюючи мікроорганізми – ґрунти біля бензоколонок, винні дріжджі на винограді, анаеробні целюлозо розкладаючи та метаноутворюючи в великих кількостях знаходяться у рубці травоїдних. Зразки вносять в рідкі поживні середовища спеціального складу – елективні. В цих середовищах створюються вибіркові умови для розвитку того чи іншого мікроорганізму. Наприклад, для накопичення продуцента холестериноксидази використовують середовища з єдиним джерелом вуглицю - холестерином, продуцентів протеолітичних або ліполітичних ферментів – середовища, які містять білки або ліпіди. Так отримують накопичувальні середовища мікроорганізмів.
Наступний етап – виділення чистих культур. Використовують щільні поживні середовища, на які засівають зразки з накопичувальних культур. Окремі клітини утворюють ізольовані колонії з яких отримують чисті культури.
Другий шлях. Мікроорганізми можна отримувати з колекцій мікроорганізмів. При цьому користуються знаннями фізіології та біохімії різних мікроорганізмів. Так, продуцентів антибіотиків частіше всього знаходять серед актиноміцетів, типові продуценти етанолу – дріжджі, для грампозитивних бактерій характерно виділення гідролітичних ферментів.
Усі процеси життєдіяльності мікроорганізму направлені на безупинний ріст та поділ до тих пір, поки середовище буде містити мінімальні умови для цього. Усі процеси у бактеріальній клітині підпорядковані жорстким правилам економії. Жоден з первинних метаболітів не утворюється більше необхідного. Для промислових завдань генетична програма клітини повинна бути перебудована таким чином, щоб спрямувати потенціал біосинтезу клітини не на самовідтворення, а на виробництво необхідного продукту.
ВИМОГИ ЩОДО ПРОДУЦЕНТІВ-МІКРООРГАНІЗМІВ:
1. Здатність синтезувати цільовий продукт.
2. Володіння високою швидкістю росту.
3. Використання для життєдіяльності дешеві нехарчові субстрати.
4. Стійкість до зараження сторонньою мікрофлорою.
Одноклітинні організми характеризуються більшою швидкістю синтетичних процесів, ніж вищі форми життя. Так, корова масою 500 кг за добу синтезує 0,5 кг білка. Таку ж кількість білка за добу можна отримати від 5 г дріжджів.
Фотосинтезуючи мікроорганізми використовують найдешевші джерела енергії, вуглеводу, відновних еквівалентів та азоту. Фототрофні мікроорганізми перспективні як продуценти аміаку, водню, білку та різних біопрепаратів. Окремо слід відмітити створення нових технологій мікробіологічного виробництва на базі біоконверсії сонячної енергії.
Термофільні мікроорганізми оптимально ростуть при високих температурах (60-80,110оС, на океанічних глибинах знайдені мікроорганізми, здатні розвиватися під тиском при 300оС), що затрудняє розвиток сторонньої мікрофлори. Серед термофілів виявлені продуценти спиртів, амінокислот, ферментів, молекулярного водню. Використання термофілів дозволить знизити затрати на стерилізацію обладнання. Швидкість росту у термофілів у 1,5-2,0 рази вища, ніж у мезофілів. Термофіли Thermus caldophilus та T. аquaticusсинтезують протеази стійкі до нагріваня. Активність протеази при 20 оС у 100 разів нижча, ніж при 75оС. (використання у харчовій промисловості).
Виділення та підбір об’єкта – важливий етап біотехнологічного процесу. Проте шляхом простого підбору отримати високоактивні продуценти не вдається, тому використовують методи селекції.
Питаннями вдосконалення промислових мікроорганізмів займаються мікробіологи селекціонери. Так, багаторічна селекція штамів продуцентів пеніциліну дозволила підвищити активність від 100 до 40000 од/мл.
Селекція – це направлений відбір мутантів, тобто відбір організмів, спадковість яких перетерпіла зміни у наслідку структурної модифікації у нуклеотидній послідовності ДНК.
СТРАТЕГІЯ СЕЛЕКЦІЙНОЇ РОБОТИ З МІКРООРГАНІЗМАМИ:
· Пошук природних форм, які володіють корисними якостями для людини (синтез цінної сполуки, висока швидкість росту, здатність до засвоєння дешевих та доступних матеріалів)
· Створення на їх базі промислових штамів.
Це відбувається шляхом зміни регуляції метаболічної активності мікробної клітини.
Генеральний шлях селекції – шлях від сліпого відбору продуцентів до свідомого конструювання їх геномів.
Методи сучасної селекції – генетичне конструювання, т.т. сукупність маніпуляцій, за допомогою яких змінюють генетичну програму мікроорганізмів.
Генетичне конструювання in vivo – отримання та виділення мутантів з використанням різних способів обміну спадковою інформацією живих мікробних клітин
Генетичне конструювання in vitro базується на використанні генетичної інженерії (рекомбінантні ДНК). Поділ умовний, тому що вони взаємопов’язані.
МУТАГЕНЕЗ ТА МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ МУТАНТІВ.
Фундамент для сучасної селекції складає методи виділення клонованих культур.
Клон – це генетично однорідні нащадки однієї клітини (колонія, яка виросла з однієї клітини при посіві на тверде середовище)
Варіант – нащадки клона, які зявляються в результаті мінливості при наступних пересівах клонової культури
Штам - клонована за походженням культура, спадкова однорідність якої підтримується відбором за специфічнимиознаками
Основна задача селекційної роботи – підтримування високопродуктивних штамів – продуцентів.
Важливий метод селекції – відбір мутантів.
Мутант – організм із зміненими спадковими ознаками, які зявляються в результаті мутації.
Мутації є
1. цитоплазматичні (які торкаються позахромосомні генетичні детермінанти)
2. Ядерні (хромосомні) включають
a. Зміна числа хромосом.
b. Зміна числа та порядку розташування генів (генетичні перебудови).
c. Ззміна індивідуальних генів (внутришньогенні зміни).
В селекції мікроорганізмів основне значення мають останні два типа мутацій.
Хромосомні перебудови включають:
· Випадіння ділянок хромосоми (делеції).
· Подвоєння числа окремих генів (дуплікації).
· Помноження (ампліфікації) числа окремих генів.
· Вставки ділянок хромосом в нові місця (транспозиції).
· Обмін ділянками між хромосомами транс локації.
· Зміна розташування генів у хромосомі (інверсії).
Внутришньогенні мутації змінюють послідовність основ ДНК у межах одного гену. При мутаціях зі зсувом рамки у клітинах синтезується неактивний білок зі зміною послідовностей амінокислот.
При транзиціях виникає заміна якого не будь одного пурину (аденіна або гуаніна) або пиримидіна (тиміна або цитозина) на інший пурин або пиримидин відповідно.
При трансверсіях пуринові основи замінюються на одно з двух пиримідинових та навпаки.
Якщо амінокислота, яка кодується мутантним геном, виявляється схожою з амінокислотою, яка кодується диким штамом, то виникає мутантний фенотип з частково порушеною функцією (leaky-мутант).
Важливою характеристикою мутантів є їх здатність до реверсій, тобто зворотному матуванню до висхідного фенотипу. Такі мутанти називаються ревертантами (точкові мутації).
За походженням мутації є спонтанні (низька частота виникнення) та індуковані.
Наприклад, щоб виявити колонію Lac- (нездатність зброжувати лактозу) серед колоній E/ coli дикого типу (Lac+) необхідно продивитися 100000 клонів.
Коли неможливо провести прямий відбір мутантів, досліджують колонії на індикаторних чашках, застосовують тест-культури мікроорганізмів, метод відбитків (реплік). Інколи вирощують кожну окрему колонію та визначають у культуральній рідині активність.
Індикаторні чашки - містять середовища з індикатором, якій виявляє різницю рН між колоніями, які метаболізують або ні певні вуглеводи. Мутанти різняться за коліром колоній та фенотипом. (на агарі з трифенілтетразолієм колонії, які не зброджують лактозу, набувають червоного коліру, а колонії які зброджують залишаються незафарбованими). Інколи вносять субстрати, які змінюють прозорість середовищ – навколо колоній мутантів утворюються прозорі зони.
Метод тест-культур використовують ауксотрофи та чутливі до антибіотиків культури. Характеристику мутантів проводять за зоною росту або пригнічення, а також структурою, формою та прозорістю колоній.
Метод відбитків (реплік) Ледерберг Д, 1952р.
1. Чашки Петрі засівають з розрахунку на чашку 50-200 колоній.
2. Стерильний оксамит або фільтровальний папір натягують на металевий циліндр та закріплюють. Чашки з колоніями прикладають до поверхні оксамиту.
3. Потім до цього оксамиту з відбитками колоній прикладають чисті чашки з різними середовищами.
4. Після культивування на них утворюються колонії у аналогічному розташуванні. На чашках з мінімальними середовищами можна виявити ауксотрофні мутанти. Різні модифікації цього метода використовуються для виділення мутантів з поживними потребами, а також мутантів чутливих до фізичних, хімічних та біологічних факторів (температура, фаги, антибіотики).
Метод відбитків можна модифікувати застосуванням безпосередньо у середовищі антибіотиків, які убивають ростучі клітини. Наприклад, ауксотрофний мутант E. Coli за треоніном не росте на мінімальному середовищі без треоніну.В таких умовах пеніцилін буде вбивати лище прототрофні клітини. Якщо необхідна мутація виникла спонтанно з частотою 10 -7, тоді достатньо передивитися декілька тисяч колоній, які вижили після обробки пеніциліном, щоб знайти колонію необхідної мутації.
Якщо це стосується спороутворюючих мікроорганізмів, частку ауксотрофних мутантів можна підвищити прогріванням культур, які проростають у мінімальному середовищі. Прототрофи, які проростуть при нагріванні загинуть, а ауксотрофи, які перебувають у вигляді спор, виживуть та проростуть на збагаченому середовищі.
Міцеліальні гриби для виділення ауксотрофних мутантів використовують метод збагачення при фільтруванні. Під час культивування на мінімальних середовищах прототрофні клітини поділяються та утворюють великі частки, які затримуються фільтром, а клітини, які не діляться промиваються у фільтрат.
Ауксотрофні мутанти представляють значний інтерес для селекції промислових мікроорганізмів. Наприклад, гомосеринові ауксотрофи глутаматпродукуючих коринеподібних бактерій Corynebacterium glutamicum єефективними продуцентами лізіну. Мутації ауксотрофності можуть підвищувати вихід цілевого продукту, змінюючи регуляцію його біосинтезу. Розповсюджений метод отримання продуктивних штамів – виділення ауксотрофів та відбір псевдоревертантів, які несуть регуляторні мутації. Ауксотрофні мутанти використовують під час отримання рекомбінантних штамів у генетичних схрещеннях.
Вміст мутантів у мікробній популяції можна збільшувати шляхом мутагенезу. Вибір мутагену визначається типом мутації, яку бажано отримати, а також ефективність мутагену по відношенні до даного організму.
Індукований мутагенез та відбір продуктивних мутантів є важливим методом підвищення активності промислових штамів мікроорганізмів.
При цьому оброблену мутагеном культуру розсівають на щільні поживні середовища з розрахунку отримання окремі колонії. Кожен клон досліджують на продуктивність. Виділив більш продуктивний варіант, процедуру мутагенезу та відбору повторюють тобто проводять ступеневий відбір. В процесі мутагенезу та відбору можуть бути отримані мутації, які призводять до конститутивного синтезу відповідних ферментів, які усувають ретроінгібування, катаболітну та азотну репресії, які підвищують пул попередників цілевого продукту, змінюючи клітинну енергетику та проникність мембран. Саме тому цей метод ефективно використовується для відбору штамів продуцентів антибіотиків.
Недолік методу - надзвичайно важкий у виконанні (можна роками створювати штам, але не завжди отримувати бажаний результат).
Досягнення молекулярної генетики дозволили проводити відбір продуцентів за стійкістю їх до структурних аналогів цільового продукту. Метод базується на регуляції ферментів за принципом зворотного зв’язку кінцевого продукту біосинтетичного шляху. Підвищення концентрації метаболіту інгибує активність ферменту, який приймає участь у синтезі метаболіту, або репресує синтез цього ферменту. Наприклад, за наявності глюкози та NH4+ клітини багатьох бактерій синтезують усі необхідні для життєдіяльності азотмісні сполуки. Якщо у середовище додати певну амінокислоту, то її синтез швидко припиняється. В цих умовах виживають лише де які клітини - мутанти з порушеною регуляцією активності та синтезу ферментів. Бажані ті мутанти у яких фермент зберіг функціональну активність, але втратив чутливість до інгибуючої дії кінцевого продукту або його аналога. Синтез ферменту стійкий до надлишку продукту або його аналога.Подібні мутації призводять до появи зверхпродуцентів, які синтезують цільовий метаболіт у аномально високих концентраціях.
Якщо необхідно досягти накопичення не кінцевого, а проміжного продукту біосинтетичного шляху тоді використовують мутантів, у яких заблокований наступний за інтермедіатом етап синтезу. Такий мутант ауксотрофен - росте лише при додаванні у середовище культивування речовини, яка є продуктом блокованої реакції.
В селекції продуцентів ферментів важливе значення має отримання конститутивних мутантів. З цією метою можна використовувати метаболізуючи аналоги субстратів, не здатних викликати індукцію. На чашках, де такі сполуки є єдиним джерелом вуглецю та енергії утворюються колонії лише мутантів, які синтезують відповдні ферменти конституітивно.
Мутації стійкості до ріфампіцину пошкоджують РНК-полімеразу, а мутації стійкості до стрептоміцину- білок малої субодиниці рибосоми. Стійкість до цих антибіотиків підвищує вихід лізину у штамів продуцентів Corynebacteriumglutamicum. Енергетичний стан клітини може суттєво впливати на процеси біосинтезу у клітині. Наприклад,зверхсинтез проліну гистидинзалежними мутантамиBrevibacterium flavum пов’язаний зі збільшенням у них внутрішньоклітинного пулу АТФ. Надлишок неорганічного фосфату середовищі, підвищуючи пул АТФ, пригнічує синтез антибіотиків хлор тетрацикліну та кандицидіну продуцентамиStrept. aureofaciens та Strept. griseus.