ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 17.07.2019
Просмотров: 1209
Скачиваний: 4
Мутанти, стійки до пеніциліну, бацитрацину, поліміксину, ністатину,кабіцидіну можуть бути селективно отримані на середовищах, які містять інгибуючи концентрації цих антибіотиків. В них часто спостерігається зміна проникності клітинної мембрани, яке підвищує їх продуктивність. Так, стійки до пеніциліну мутанти Cor. glutamicum продукують на 15-20% більше лізину, ніж висхідні чутливі штами. МутантиCephalosporium acremonium стійкі до ністатину, кабіцидину виділяють у середовище більше 10 г/л цефалоспорину С. Мутанти Trichoderma reesei стійкі до кабіцидіну секретують підвищену кількість целюлози.
АКТУАЛЬНІСТЬ ВАКЦИНОПРОФІЛАКТИКИ
Жодній медичній науці людство не зобов'язано спасінням життя як вакцинології. Вакцинопрофілактика довела свою ефективність як найбільш економічний засіб попередження інфекційних хвороб.
Основним завданням досліджень у галузі вакцинології є розробка безпечних та високоефективних вакцинних препаратів.
Весь шлях створення вакцин став можливим завдяки використанню основних досягнень біотехнології:
Ø Відкриття та отримання анатоксинів.
Ø Створення клітинних ліній.
Ø Аттенуація вірусів та бактерій.
Ø Виділення та очищення поліцукрів.
Ø Рекомбінантні технології.
Історія імунології – приклад чисто емпіричного методу. Стійкість до повторного зараження при масових заразних хворобах, особливо при віспі, здавна відома людству. Люди, що перехворіли, без остраху доглядали за хворими у центрі епідемії. На основі цих спостережень у народів Китаю, Турції виник метод віспощеплення матеріалом віспінних струпів. Аналогічний метод з’явився у тваринництві. У Західній Африці деякі племена проводили щеплення проти контагіозної плевропневмонії ВРХ: кінчиком кинджалу, якій був змочений ексудатом уражених легень, надрізали шкіру лоба.
У Англії було замічено, що доярки, які перехворіли на віспу корів не хворіли на чорну віспу. Ці спостереження стали основою відкриття вакцинації проти віспи, яка стала першим усвідомленим масовим щепленням у світі. Процедура, яку започаткував Едвард Дженнер, називалася вакцинацією від лат. назви vacca - корова.
Зародження імунології як науки має початок у 80-х роках 19 сторіччя, коли Л.Пастер отримав ефективні вакцини проти холери курей, сибірки, бешихи, сказу. Таким чином науково обґрунтував можливість специфічної профілактики інфекційних хвороб тварин і людей.
Вакцинопрофілактика – стимуляція імунної відповіді при введені вакцинних препаратів з метою створення захисного імунітету до різних інфекцій. При цьому відбувається активація імунної системи за наступною схемою:
Ø Захват макрофагами антигенних субстанцій
Ø Надання макрофагами інформації про антиген Т-лімфоцитам
Ø Проліферація і диференціація Т-клітин з появою регуляторних хелперів і супресорів
Ø Перетворення активованих В-клітин у плазматичні антитіло продукуючи клітини
Ø Формування клітин памяті
Ø Продукція специфічних антитіл.
ЖИВІ ВАКЦИНИ - препарати, які складаються з атенуйованих збудників інфекційних хвороб, при цьому бактерії і віруси не здатні викликати специфічні захворювання, проте зберігають здатність розмноження у організмі вакцинованої тварини та створенню активного імунітету.
Аттенуація досягається наступними методами:
А. Штучне отримання аттенуйованих штамів збудників:
a. шляхом тривалого культивування на поживних середовищах в умовах не оптимальних для росту
b. Методом адаптації до нового господаря
c. Дія мутагену на генетичний матеріал мікроорганізма
Б. Штучне отримання генетичних рекомбінантів, які зберегли імуногенність при зниженій вірулентності
В. Селекція спонтанних мутантів з послабленою вірулентністю але зі збереженням імуногенності.
Переваги - висока напруженість і тривалість імунітету. Живі вакцини активізують усі ланки імунної системи, зумовлюючи збалансовану імунну відповідь.
Недоліки – реактогенність, яка може призвести до вакцинальних ускладнень. У аттенуйованих вакцинних штамів не виключається можливість реверсії до дикого типу внаслідок генетичної нестабільності. Живі вакцини можуть бути контаміновані інфекційними агентами (вірусами, бактеріями, мікоплазмами), які персистують у біологічних системах. Вони чутливі до несприятливих факторів (ТоС, світло).
ІНАКТИВОВАНІ ВАКЦИНИ - отримують шляхом інактивації вірусів чи бактерій фізичними методами( температура, опромінення) та хімічними методами (формальдегід, глутаровий альдегід, фенол).
Усі інактиватори є сильними мутагенами. При абсолютній інактивації вони мають зумовити такі зміни геному, які унеможливлюють його транскрипцію, трансляцію чи реплікацію. Послідовність інактивації така: спочатку втрачається інфекційність, а потім – імуногенність. Тому у динаміці цього процесу можливий такий проміжний момент, коли ще зберігається деяка кількість інтактних вібріонів, інфекційність яких уже не можливо виявити звичайним зараженням чутливих біологічних об’єктів у зв’язку з блокуванням їхньої репродукції значно більшою пропорцією інактивованих віріонів.
Перевага – повна безпечність
Недоліки – менша імуногенність, у зв’язку з чим треба збільшувати дозу і кратність введення препарату.
СУБОДИНИЧНІ ВАКЦИНИ – складаються з проективних антигенів, що стимулюють у творення вірус нейтралізуючих антитіл. Вони позбавлені клітинного баласту, який лише посилює реактогенність і може спричинити алергічні реакції.
СПЛІТ-ВАКЦИНИ- виготовляють з глікопротеїнів складно організованих вірусів, які є основними антигенами, що індукують утворення вірус нейтралізуючих антитіл. Для одержання глікопротеїнів спочатку дезінтегрують віріон, використовуючи ліпази, органічні розчинники, луги або йонні детергенти, які руйнують біліпідний шар суперкапсидної оболонки віріона. Глікопротеїн відокремлюють від субвірусних компонентів центрифугуванням у градієнті густини в поєднанні з хроматографією.
Під час виготовлення спліт-вакцин слід враховувати те, що на імуногенну активність очищенних глікопротеїнів впливає їх форма надмолекулярної організації у препараті. Міцелярні форми мають високу імуногенність, на відміну від мономерних структур. Процес виготовлення ефективних спліт-вакцин має передбачати можливість мякої неденатурувальної екстракції глікопротеїнів суперкапсидної оболонки з наступним утворенням із них мультимерних агрегатів.
Недоліки- висока вартість вакцин.
Імуногенність таких вакцин, нижча ніж у цільновіріонних. Тому їх треба вводити з адьювантами та імуномодуляторами. Підвищити іммуногенність спліт-вакцин можна, конструюючи їх у вигляді віросом. Для цього очищені вірусні глікопротеїни включають у ліпосоми, які мають адювантні властивості.
СИНТЕТИЧНІ ВАКЦИНИ – створюють хімічним синтезом епітопів проективних вірусних антигенів. Конструювання таких вакцин можливе при повному розшифруванні пептидних послідовностей антигенних детермінант. Технологічні розробки субодиничних вакцин зорієнтовані на мінімальні розміри пептидів, які стимулюють імунну відповідь організму. Ідеальна синтетична вакцина – це комплекс із кількох коротких пептидів по 5-7 амінокислотних залишків, який містить бажану комбінацію антигенних детермінант різних вірусів.
Переваги – безпечні через відсутність інфекційного вірусу, не потребують очищення антигенного матеріалу, представляють необмежені можливості для асоціації вірусних антигенів, стабільні.
Недолік – недостатня імуногенна активність. Їх треба вводити з адьювантами та імуномодуляторами або конструювати у вигляді віросом.
ГЕННО-ІНЖЕНЕРНІ ВАКЦИНИ – є продуктом спрямованої генетичної рекомбінації вірусів.
На основі технології рекомбінантної ДНК розроблено 4 типи генно-інженерних вакцин:
|
Інактивовані субодиничні вакцини, отримані шляхом мікробного синтезу |
Гепатит В |
|
Живі реасортантні вакцини |
Грип А, простий герпес, хвороба Ауєскі |
|
Рекомбінантні вакцини |
Гепатит В, грип А, сказ, хв. Ауєскі, везикулярний стоматит, хв. Ньюкасла |
|
ДНК-вакцини |
Сказ, грип А, гепатит В, кліщовий енцефаліт, хв. Ауєскі, інфекційного ринотрахеїту ВРХ, вірусної діареї ВРХ, парвовірусної інфекції собак |
|
|
|
Виробництво вакцин відбувається за узагальненою схемою технологічн их процесів виготовлення в умовах біофабрик.
Субодиничні вакцини – принцип їх створення ґрунтується на виділенні з вірусного геному генів, які кодують проективні вірусні білкі та їхнє клонування в клітинах прокаріотів або еукаріотів при використанні плаз мідного або фагового вектора. Клонована вірусна ДНК може бути експресована у вигляді вірусного білка у прокаріотичних чи еукаріотичних клітинах. Так, протективні білки вірусів ящуру, гепатиту В, грипу А, сказу, поліомієліту і простого герпесу були синтезовані в бактеріях і дріжджах. Труднощі у отриманні субодиничних вакцин пов’язані з тим, що ферментні системи в бактеріальних і дріжджових клітинах не можуть забезпечити процессинг вірусних іРНК і пост трансляційні модифікації вірусних білків (протеолітичне нарізання і глікозилювання). Це перешкоджає формуванню такої третинної й четвертинної структури вірусного білка, яка утворюється при заражені вірусом клітин вищих еукаріотів конфірмаційні відхилення вірусоспецифічних білкових молекул призводять до зниження імуногенності препарату. Цю проблему можна вирішити застосовуючи клітини людини чи тварин.
Живі реасортантні вакцини – конструюють із аттенуйованих реасортантів або делеційних мутантів, які характеризуються генетичною стабільністю. Реасортанти отримують пересортуванням генів у вірусів із фрагментованим геномом (віруси грипу А). Стабільні делеційні мутанти (наприклад, вірусів простого герпесу або хв. Ауєскі) отримують шляхом делеції відповідних генів, що призводить до втрати вірулентності при збережені імуногенних властивостей.
Живі рекомбінантні вакцини - конструюють на основі аттенуйованого вірусного вектора – вірусу віспо вакцини, в геном якого вбудовують гени проективних білків іншого вірусу (гепатиту В, грипу А, сказу, хв. Ауєскі, везикулярного стоматиту, хв. Ньюкасла). При внутришньошкірному введені такого препарату відбувається розмноження рекомбінантного вірусу з розвитком вакцинального процесу, характерного для віспо вакцини, й одночасний синтез проективних білків іншого вірусу, що індукує специфічну імунну відповідь.
ДНК-вакцини – це плазмідні ДНК із вбудованими генами проективних вірусних білків, що вводять безпосередньо у організм тварин. Рекомбінантну ДНК на основі плаз мідного вектора реплікують у клітинах E. Сoli у присутності ампіциліну, після очищення використовують як вакцинний препарат. Незначна кількість плаз мідної ДНК поглинається (0,01-1%) клітинами організму, транспортується у ядро і транскрибується клітинною РНК- полімеразою з утворенням іРНК, транслюється на рибосомах із формуванням проективного вірусного білка. Синтезований проективний білок розщеплюється клітинними протеазами на короткі пептиди ( по 8-10 амінокислот), які у комплексі з молекулами МНС транспортуються на поверхню клітини, де розпізнаються Т-хелперами. Це індукує збалансовану імунну відповідь. Плазмідна ДНК тривалий час (3-6 міс.) функціонує у клітинах організму, не реп лікується у них, не інтегрує з хромосомою і не спричиняє утворення антитіл проти неї.
Переваги – ефективність живих вакцин, безпечність інактивованих. У одну плазмідну ДНК можна вбудувати гени проективних білків кількох вірусів і гени цитоківнів – регуляторів імунної відповіді.
АД’ЮВАНТИ. Вакцина має забезпечувати тривалий захист від інфікування після однієї або декількох ін’єкцій. Це, як правило, відноситься до живих аттенуйованих вакцин. Коли для виготовлення вакцини використовують інактивовані віруси або окремі білки вірусу, тоді відмічають слабке антитіло утворення. Це можна виправити шляхом додавання речовин – ад’ювантів.
Отримують вакцини депоновані – біопрепарат, у якій додають депонуючий агент (сорбуючі або емульгуючі адюванти) з метою сповільнення виведення антигенів з організму та підвищення імунологічної ефективності інактивованих вакцин.
Вакцина комбінована – суміш вакцин різних типів, які містять різні види антигенів проти одного захворювання.
Ад’ювантна дія обумовлена наступними механізмами:
Ø Попередження швидкого розсіювання антигену від місця ін’єкції та дренування його через лімфатичні вузли;
Ø Поліпшення зв’язку антигену з макрофагами;
Ø Активація макрофагів, що викликає стимулювання Т-лімфоцитів та затримка лімфоцитів у лімфатичних вузлах.
Інактивація вірусного матеріалу.
Для інактивації використовують наступні агенти:
Ø Формальдегід, глицидальдегид – для інактивації вірусів ящуру, енцефаліту коней, чуми м’ясоїдних, трансмісивних гастроентеритів.
Ø Ацетилетиленимин –вірус ящуру;
Ø Пропіолактон – вірус ящуру, хв. Ньюкасла, сказу, чуми свиней.
Ø Гідроксиламін – грип свиней, чума птахів.
Ø Кристалвіолет, іони амонію – у комбінації з іншими інактиваторами.
Ø Ультрафіолетове опромінення у поєднанні з пропіолактоном для отримання вакцин на основі вірусів ящуру та хв. Ньюкасла.
Ø Рентгенівське та гамма- опромінення – для інактивації вірусу грипу (Ультрафіолетові та рентгенівські промені інактивують нуклеїнові кислоти вірусів, тому підвищення дози опромінення призводить до зниження антигенності препарату).
Ø Дія тепла – дуже рідко ( як правило, температуру враховують як критичний фактор під час інактивації вірусів з використанням хімічних речовин).
Інактиватори легко реагують з не вірусними білками та деякими компонентами поживних середовищ, тому під час вибору інактиватора слід враховувати ступінь чистоти препарату.
На практиці для інактивації застосовують неспеціалізоване обладнання. Для хімічної інактивації вірусів у суспензіях підходить обладнання звичайного ємкісного типу. Особливу увагу звертають на ретельне перемішування. Прийнято перемішувати інактиватор з вірусною суспензією у одному посуді, а потім переносити суміш у інший. Неінактивовані вірусні частки будуть залишатися у першій посудині.
Основною відмінністю живих вакцин від інактивованих є кількість вірусного матеріалу, що входить у дозу. Головна проблема технології виготовлення інактивованих вакцин – щоб у дозу було включено достатня кількість вірусного антигену. Для живої вакцини достатня доза 103ТЦД50, тоді як для інактивованої необхідно еквивалент 107-108 ТЦД50. Тому концентрація вірусу у дозі інактивованної вакцини повинна перевищувати дозу живої вакцини у 10-100000 разів. Тому необхідно препарати концентрувати.
Ліофілізація або сублімаційна сушка у вакуумі попередньо заморожених біологічних матеріалів – один з сучасних методів зворотного концентрування мікроорганізмів та біопрепаратів. Цей метод складається з двох фаз: заморожування та висушування, під час якого вологу випаровують під вакуумом, мінуючи рідку фазу. У процесі сублімації волога переміщується у препараті не у вигляді рідини, а у вигляді пари, що дозволяє максимально зберегти специфічні властивості білків та звести до мінімуму процеси денатурації та обміну речовин. Це дозволяє перехід мікроорганізмів у стан тривалого анабіозу.