Файл: Белки_2003.doc

1. Гидролиз нуклепротеидов дрожжей

Для изучения химического состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей и обнаруживают продукты гидролиза- полипептиды, азотистые основания, углеводы и фосфорную кислоту.

Ход работы:

1) Гидролиз нуклеопротеидов. Отвешивают 1 г прессованных дрожжей или 0,2 г сухих дрожжей и переносят в круглодонную колбу, вливают 15-20 мл 10%-ного раствора серной кислоты, закрывают колбу пробкой с воздушным холодильником и ставят в водяную баню на 1 час с момента закипания жидкости. Затем колбу охлаждают, содержимое фильтруют и проделывают следующие реакции.

2) Биуретовая реакция на полипептиды. К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10%-ного раствора NaOH и 1 каплю 1%-ного раствора сернокислой меди. Жидкость окрашивается в сине-фиолетовый цвет вследствие образования биуретового комплекса между пептидной группировкой и ионами меди.

3) Открытие пуриновых оснований. К 1 мл фильтрата добавляют по каплям концентрированный раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус и приливают 0,5 мл аммиачного раствора окиси серебра. Выпадают в осадок серебряные соли пуриновых оснований.

4) Качественные реакции на рибозу и дезоксирибозу.

Окрытие рибозы и дезоксирибозы основано на их способности восстанавливать соли металлов (меди, висмут, серебро) в щелочной среде. При этом металлы восстанавливаются из окисной формы в закисную или в случае закиси - до свободного состояния; пентозы при этом окисляются с образованием соответствующих кислот.

Реакция Троммера заключается в восстановлении окисной меди в закисную под влиянием рибозы и дезоксирибозы, образующихся в результате гидролиза нуклеопротеидов дрожжей. Реакции протекают по уравнениям:

CuSO₄ + 2NaOHCu(OH)₂ + Na₂SO₄

К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30%-ного раствора NaOH и 5 капель раствора CuSO₄до появления осадка гидроокиси меди Cu(OH)₂. Жидкость перемешивают и кипятят. Выпадает осадок желтого цвета (CuOH) или красного (Cu₂O).

Пентозы можно определить и по реакции с тимолом и концентрированной серной кислотой. Последняя вызывает дегидратацию пентоз и образование фурфурола, который с тимолом дает соединение красного цвета:

К 5 каплям фильтрата добавляют 1 каплю 1%-ного спиртового раствора тимола и осторожно наслаивают 5 капель концентрированной кислоты. Жидкость окрашивается в красный цвет.

5) Молибденовая проба на фосфорную кислоту.

К 10 каплям молибденового реактива (молибденовокислый аммоний в азотной кислоте) добавляют 5 капель гидролизата дрожжей и кипятят на пламени спиртовки. Жидкость окрашивается в лимонно - желтый цвет. После охлаждения пробирки выпадает желтый осадок комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония:

12(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄+ 2I HNO₃=2INH₄NO₃+ (NH₄)₃ PO₄ ·12 MoO₃ + 12H₂O

Материалы и реактивы:дрожжи хлебопекарные, пресованные или сушеные;10%-ный раствор серной кислоты;10%-ный раствор едкого натра;1%-ный раствор сернокислой меди;концентрированный раствор аммиака;30%-ный раствор едкого натра;7%-ный раствор сернокислой меди;1%-ный спиртовой раствор тимола;концентрированная азотная кислота;молибденовый реактив (см. приложение Б, п.15)

Оборудование:. пробирки обыкновенные; колбы с воздушным холодильником; водяная баня; спиртовка; пипетки; лакмус.

Список используемых источников

1. Биохимия: Практикум.–К.:Выща шк.Изд–во при Киев. ун–те,1988. – 128с.

2. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача.–Екатеринбург: Издательско–полиграфическое предприятие «Уральский рабочий»,1994.–384с.

3. Кретович В.Л.Биохимия растений.–М.:Высш.шк.,1986.–503с.

4. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник.–М.: Медицина,1987.– 368 с.

5. Марри Р.,Греннер Д.,Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека; В 2–х т.–М.: Мир,1993.

6. Мелентьева Г.А.Фармацевтическая химия.т.II.–М.:Медицина,1976.–827 с.

7. Методы анализа пищевых, сельскохозяйственных продуктов и медицинских препаратов.– М.:Пищевая промышленность,1974.–743 с.

8. Практикум по биохимии сельскохозяйственных животных.– М.: Высш. школа,1980.–303 с.

9. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии – Ростов-на-Дону: Изд–во «Феникс», 1999.–544 с.

10. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина,1976.–294 с.

11. Справочник биохимика.– М.: Мир,1991.–554 с.

12. Филлипович Ю.Б., Основы биохимии: Учеб. для хим. и биолог. спец. пед. ун–тов и ин–тов.– 4–е изд., перераб. и доп.– М.: изд–во «Агар», 1999.–512с.

13. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии.– Мн.: Вышэйш. школа,1976.–288 с.

14. 18.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник.– 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 1998.– 704 с.

Приложение а

(справочное)

Значение рК для ионизируемых групп в аминокислотах

Таблица А. 1 - Значение рК для ионизируемых групп в аминокислотах

Приложение б

(справочное)

Методики приготовления реактивов

1. Разбавленный раствор яичного альбумина. Белок одного куриного яйца, отделенный от желтка, хорошо взбивают и смешивают в колбе при встряхивании с десятикратным объемом воды. Раствор фильтруют через двойной слой смоченной водой марли, помещенный в воронку.

2. Раствор растительного альбумина. 25 г пшеничной муки смешивают со 100 мл воды и встряхивают в течение часа с помощью встряхивателя. Взвесь муки центрифугируют. Прозрачный центрифугат содержит преимущественно альбумин.

3. Раствор глиоксиловой кислоты. К 2 г Мgв порошке, слегка увлажненному, приливают при охлаждении 50 мл заранее охлажденного до 0⁰С насыщенного раствора щавелевой кислоты. Осадок оксалата магния растворяют, отфильтровывают и промывают небольшой порцией воды. Фильтрат подкисляют уксусной кислотой и доводят водой до объема 200 мл. Раствор хранят в холодильнике.

4. Раствор яичного альбумина. Белки куриных яиц отделяют от желтков, смешивают с 15–20 кратным объемом воды и фильтруют через несколько слоев марли.

5. Раствор яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония. Белки из трех куриных яиц отделяют от желтков, смешивают с 700 мл дистиллированной воды и 300 мл насыщенного раствора сернокислого аммония и отфильтровывают через несколько слоев марли.

6. Смешанный индикатор Гроака. Отвешивают 0,14 г метилового красного и 0,07 г метилового синего и растворяют в 150 мл 95% -ного этилового спирта.

7. Титрованный 0,02н раствор серной кислоты с индикатором Гроака и борной кислотой. 6 мл серной кислоты (относительная плотность 1,84) и 30 мл индикатора Гроака (см. приложение Б, п.6) растворяют в 10 л воды. К этому раствору добавляют 60 г борной кислоты.

Определение поправки на нормальность раствора серной кислоты: 1,9064 г пе рекристаллизованной буры растворяют в 100 мл воды и 20 мл полученного 0,1н раствора разбавляют водой до 100 мл в мерной колбе. 10 мл точно 0,02н раствора буры титруют раствором серной кислоты (в трех повторностях) и определяют поправку к нормальности серной кислоты путем отношения объемов 0,02н растворов буры и серной кислоты.

8. Селеновый катализатор. В фарфоровой ступке тщательно растирают 100 г К₂SО₄, 15,64 г СиSО₄· 5 Н₂О и 1 г металлического селена до однородной смеси.

9. Метиленовый красный. 0,2 г метиленового красного растворяют в 60 мл 96%-ного этилового спирта и добавляют 40 мл воды.

10. 0,1% раствор белка казеина по Гаммарстену на фосфатном буфере. 3,8 г Na₃PO₄ ^. 12H₂O растворяют в 80 мл дистиллированной воды при 40^оС, добавляют 100 мг казеина по Гаммарстену и после полного растворения последнего устанавливают рН смеси 1н НСI на уровне 6,5; объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл.

11. Реактив А. 2 г NaOH и 10 г Na₂CO₃+ 500 мл дистиллированной воды.

12. Реактив В. 5 мл 1,1 % раствора К-Na виннокислого + 0,5 мл раствора СиSO₄^.5H₂O.

13. Реактив С. 50 мл реактива А + 1 мл реактива В. Готовится перед каждой работой.

14. Реактив Фолина. 10 г Nа₂WоО₄2Н₂О (перекристаллизованный) и 2,5 гNа₂МоО₄2Н₂О помещают в круглодонную колбу на 200-250 мл, приливают 70 мл воды и хорошо перемешивают. К полученному раствору добавляют 5 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной НСI. Колбу на шлифе присоединяют к обратному холодильнику, после чего смесь нагревают при умеренном кипячении в течение 10 часов. После кипячения прибавляют 15 г сернокислого лития (Li₂SO₄), 5 мл дистиллированной воды, 1 каплю брома (бромной воды). Избыток брома удаляют кипячением под тягой без холодильника в течение 15 мин, после чего жидкость охлаждают и разводят дистиллированной водой до 100 мл, фильтруют через стеклянный фильтр или бумажный, разводят водой с таким расчетом, чтобы получился раствор 1н кислоты. Для этого кислотность реактива определяют предварительно, титруя разведенный в 10 раз реактив 0,1н щелочью в присутствии фенолфталеина до слабо-розовой окраски. Реактив может храниться в темной склянке длительное время. Перед употреблением реактив разводят водой в отношении: 1 часть реактива и 3 части дистиллированной воды.

15. Молибденовый реактив: 3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды и добавляют 50 мл 32%-ной азотной кислоты ().