Файл: Naselenie_Gornogo_Altaya_v_epokhu_rannego_zheleznogo_veka_kak_etnokulturny_fenomen.pdf

ÃËÀÂÀ. 3. ÏÀËÅÎÃÅÍÅÒÈ×ÅÑÊÈÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß ÍÎÑÈÒÅËÅÉ ÊÓËÜÒÓÐÛ ÐÀÍÍÅÃÎ ÆÅËÅÇÍÎÃÎ ÂÅÊÀ

ÈÍÒÅÃÐÀÖÈÎÍÍÛÅ  ÏÐÎÅÊÒÛ

121

Ã

ËÀÂÀ

 3

ÏÀËÅÎÃÅÍÅÒÈ×ÅÑÊÈÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß

ÍÎÑÈÒÅËÅÉ ÊÓËÜÒÓÐÛ ÐÀÍÍÅÃÎ ÆÅËÅÇÍÎÃÎ ÂÅÊÀ

ÃÎÐÍÎÃÎ ÀËÒÀß (ÏËÎÑÊÎÃÎÐÜÅ ÓÊÎÊ)

Ñîâðåìåííûå ìåòîäû ìîëåêóëÿðíîé ãåíåòèêè ïîçâîëÿþò ïîëó÷àòü ãåíîòèïè÷å-

ñêèå õàðàêòåðèñòèêè ÄÍÊ ïðåäñòàâèòåëåé ðàçíûõ èñòîðè÷åñêèõ ýïîõ. Âûäåëåíèå

è êëîíèðîâàíèå ÄÍÊ èç åãèïåòñêîé ìóìèè âïåðâûå áûëî îñóùåñòâëåíî Ñ. Ïààáî

â 1986 ã. [1]. Äàëüíåéøèé ïðîãðåññ â ýòîé îáëàñòè ñâÿçàí ñ èçîáðåòåíèåì ïîëèìåðàç-

íîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ), ïîçâîëÿþùåé in vitro íàðàáàòûâàòü ñîòíè ìèëëèîíîâ

êîïèé îò îïðåäåëåííûõ ó÷àñòêîâ ìîëåêóëû ÄÍÊ. Íà îñíîâå ÏÖÐ â 1990-õ ãã. áûëè

ïðîâåäåí ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêèé àíàëèç îñòàíêîâ «Àéñìåíà» — òèðîëüñêîãî ÷å-

ëîâåêà, èçâëå÷åííîãî èç ëåäíèêà [2], ðàñøèôðîâàíà íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëü-

íîñòü ôðàãìåíòà ìèòîõîíäðèàëüíîé ÄÍÊ (ìòÄÍÊ) íåàíäåðòàëüöà [3], âûïîëíåí ðÿä

èññëåäîâàíèé, ñâÿçàííûõ ñ àíàëèçîì îñòàíêîâ ïðåäñòàâèòåëåé äðåâíåãî íàñåëåíèÿ

ßïîíèè [4], Íîâîãî Ñâåòà [5], Åâðîïû [6] è Ðîññèè [7].

Ïðè âñåõ ñîâðåìåííûõ äîñòèæåíèÿõ ìåòîäîëîãèè èññëåäîâàíèÿ ñòðóêòóðû ÄÍÊ

ðàáîòà ñ äðåâíåé ÄÍÊ âñåãäà îñëîæíåíà ìíîãèìè íå ïðåäâèäåííûìè äëÿ åå àíàëèçà

îáñòîÿòåëüñòâàìè.

Íåïðåäâèäåííûå òðóäíîñòè ìîãóò áûòü îáóñëîâëåíû ðàçíîé ñòåïåíüþ ñîõðàí-

íîñòè ìîëåêóë ÄÍÊ â îñòàíêàõ, íàëè÷èåì â áèîëîãè÷åñêèõ ïðåïàðàòàõ îðãàíè÷å-

ñêèõ è íåîðãàíè÷åñêèõ ïðèìåñåé, èíãèáèðóþùèõ ìàòðè÷íûé ñèíòåç ÄÍÊ è ïîëèìå-

ðàçó, â ÷àñòíîñòè, îïàñíîñòüþ çàãðÿçíåíèÿ àíàëèçèðóåìûõ îáðàçöîâ ñîâðåìåííîé

ÄÍÊ è åå ïðîäóêòàìè ÏÖÐ. Äî ïðîâåäåíèÿ íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ ôðàãìåíòû äðåâ-

íèõ îáðàçöîâ ÄÍÊ âûäåëÿëè, êàê ïðàâèëî, îòíîñèòåëüíî íåáîëüøîãî ðàçìåðà,

ïî ñðàâíåíèþ ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè íóêëåîòèäîâ, èçâëåêàåìûõ èç ñîâðåìåííîãî

ìàòåðèàëà äëÿ àíàëèçà ñòðóêòóðû ÄÍÊ. Ýòî îáñòîÿòåëüñòâî ñóùåñòâåííî îãðàíè÷è-

âàëî ïîëó÷åíèå ãåíåòè÷åñêîé èíôîðìàöèè â íåîáõîäèìîì îáúåìå è ñíèæàëî âîç-

ìîæíîñòü îïðåäåëåíèÿ ðàñîâûõ è ýòíè÷åñêèõ îñîáåííîñòåé ñòðóêòóðû ÄÍÊ ó èíäè-

âèäîâ ïðîøëûõ èñòîðè÷åñêèõ ýïîõ.

Ñëåäîâàëî èìåòü â âèäó òàêæå, ÷òî äëÿ âîññîçäàíèÿ ñòðóêòóðû ãåíîôîíäà ïàçû-

ðûêöåâ (IV—III ââ. äî í. ý.) è îïðåäåëåíèÿ ðîäñòâåííûõ ñâÿçåé ýòèõ äðåâíèõ êî÷åâ-

íèêîâ ñ ñîâðåìåííûìè ýòíè÷åñêèìè ãðóïïàìè Åâðàçèè íåîáõîäèìî áûëî ïðîàíàëè-

çèðîâàòü çíà÷èòåëüíîå ÷èñëî äðåâíèõ îáðàçöîâ ÄÍÊ îò ðàçíûõ èíäèâèäîâ, è ïîýòî-

ìó ìåòîäè÷åñêèå ïîäõîäû, èñïîëüçóåìûå â ýêñïåðèìåíòå, ïî ìåðå âîçìîæíîñòè äîë-

æíû áûëè áûòü óíèôèöèðîâàíû. Êðîìå òîãî, ïî èñòå÷åíèè âðåìåíè ñòàëî ÿñíî, ÷òî

äëÿ ïðîâåäåíèÿ àäåêâàòíîãî ôèëîãåîãðàôè÷åñêîãî àíàëèçà âðÿä ëè ìîæíî îãðàíè-

÷èòüñÿ ñðàâíèòåëüíûì èññëåäîâàíèåì ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé íóêëåîòèäîâ òîëüêî êîí-

òðîëüíîãî ðàéîíà ìòÄÍÊ è ìîæåò âîçíèêíóòü íåîáõîäèìîñòü àíàëèçà ñòðóêòóðû ÄÍÊ

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

122

ÈÍÒÅÃÐÀÖÈÎÍÍÛÅ  ÏÐÎÅÊÒÛ

ÍÀÑÅËÅÍÈÅ ÃÎÐÍÎÃÎ ÀËÒÀß Â ÝÏÎÕÓ ÐÀÍÍÅÃÎ ÆÅËÅÇÍÎÃÎ ÂÅÊÀ ÊÀÊ ÝÒÍÎÊÓËÜÒÓÐÍÛÉ ÔÅÍÎÌÅÍ

íåêîòîðûõ ó÷àñòêîâ ÿäåðíîãî ãåíîìà (X- è Y-õðîìîñîì, àóòîñîìíûõ ãåíåòè÷åñêèõ

ìàðêåðîâ). Ïîýòîìó ñëåäîâàëî ðàçðàáàòûâàòü òàêèå ìåòîäû, êîòîðûå áûëè áû ïðè-

ãîäíûìè äëÿ âûäåëåíèÿ äîñòàòî÷íî ñóùåñòâåííûõ êîëè÷åñòâ ÄÍÊ è ïîçâîëÿëè áû

ïåðåðàáàòûâàòü áîëüøîé îáúåì èñõîäíîãî êîñòíîãî ìàòåðèàëà. Ó÷èòûâàÿ òîò ôàêò,

÷òî òåððèòîðèþ, çàíèìàåìóþ ïàçûðûêöàìè (Ãîðíûé Àëòàé), íà ïðîòÿæåíèè äëè-

òåëüíîãî ïåðèîäà âðåìåíè îêðóæàëè àðåàëû ðàçíîðîäíûõ íå òîëüêî â ýòíè÷åñêîì, íî

è â àíòðîïîëîãè÷åñêîì îòíîøåíèè ïîïóëÿöèé, êîòîðûå, ê òîìó æå, ñî âðåìåíåì çàìå-

ùàëèñü äðóãèìè, òðåáîâàëîñü ïîäâåðãíóòü ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêîìó àíàëèçó òàê-

æå è ÄÍÊ ïðåäñòàâèòåëåé ìàêñèìàëüíî âîçìîæíîãî ÷èñëà ñîâðåìåííûõ ýòíè÷åñêèõ

ãðóïï äëÿ âûÿâëåíèÿ èõ ðîäñòâåííûõ ñâÿçåé ñ ïàçûðûêöàìè.

Ê íà÷àëó ïðîâåäåíèÿ íàñòîÿùèõ èññëåäîâàíèé ñâåäåíèÿ î ñòðóêòóðå ãåíîôîíäîâ

ÿäåðíîé è ìòÄÍÊ íàðîäîâ ñåâåðà Åâðàçèè áûëè ëèáî î÷åíü ôðàãìåíòàðíû, ëè-

áî âîîáùå îòñóòñòâîâàëè. Ïîýòîìó ïàðàëëåëüíî ñ îñíîâíûìè èññëåäîâàíèÿìè òðå-

áîâàëîñü ïðîâåäåíèå ñáîðà áèîëîãè÷åñêîãî ìàòåðèàëà îò ðàçíûõ ýòíè÷åñêèõ ãðóïï

ñåâåðà Åâðàçèè äëÿ ñîçäàíèÿ áàíêà ÄÍÊ è îñóùåñòâëåíèÿ ìàññèðîâàííîãî ñåêâåíè-

ðîâàíèÿ ýòîé ÄÍÊ.

Ïåðâûå ÷åòûðå îáðàçöà ÄÍÊ ïàçûðûêöåâ, ïîäâåðãíóòûå ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè-

÷åñêîìó àíàëèçó, áûëè ïîëó÷åíû èç õîðîøî ñîõðàíèâøèõñÿ ìÿãêèõ òêàíåé (ìûøöû,

ìîçã), ïîñêîëüêó ïîãðåáåííûå íàõîäèëèñü â ëåäÿíûõ ïðèðîäíûõ ëèíçàõ [8].

ÄÍÊ ïîãðåáåííîé â êóðãàíå Àê-Àëàõà-5 æåíùèíû [9] (îáðàçåö 1) âûäåëÿëè

èç ìûøå÷íîé òêàíè, âçÿòîé èç îáëàñòè áåäðà ñ ïîìîùüþ ñòåðèëüíûõ íîæíèö è ñêàëü-

ïåëÿ. Âíåøíå òêàíü áûëà êîðè÷íåâîãî öâåòà, ïîëíîñòüþ îáåçâîæåíà, ñîõðàíÿëà âî-

ëîêíèñòóþ ñòðóêòóðó.  êà÷åñòâå èñõîäíîãî ìàòåðèàëà äëÿ âûäåëåíèÿ ÄÍÊ ïîãðåáåí-

íûõ èç êóðãàíîâ ¹ 1 è 3 ïàìÿòíèêà Âåðõ-Êàëüäæèí-II [10] (îáðàçöû 2 è 3) èñïîëüçî-

âàëè ñâåòëî-êîðè÷íåâóþ ìàññó, èçâëå÷åííóþ ñ ïîìîùüþ ñòåðèëüíûõ èíñòðóìåíòîâ

èç ÷åðåïíîé êîðîáêè ÷åðåç çàòûëî÷íîå îòâåðñòèå. Ýòó îðãàíè÷åñêóþ ìàññó, íàõîäèâ-

øóþñÿ â æåëåîáðàçíîì ñîñòîÿíèè, èäåíòèôèöèðîâàëè êàê ñìåñü æèðîâûõ è ìîçãî-

âûõ êëåòîê.  îáùåé ñëîæíîñòè èç ïîëîñòè êàæäîãî ÷åðåïà áûëî îòîáðàíî ïî 50—

100 ã ìàòåðèàëà. Åãî õðàíåíèå îñóùåñòâëÿëîñü ïðè òåìïåðàòóðå –45 °Ñ.

Âûäåëåíèå ÄÍÊ è óäàëåíèå èíãèáèðóþùèõ ÏÖÐ-ïðèìåñåé îñóùåñòâëÿëè ñ ïî-

ìîùüþ ìîäèôèöèðîâàííîé ìåòîäèêè [11], îñíîâàííîé íà ñåëåêòèâíîé ñîðáöèè ôðàã-

ìåíòîâ ÄÍÊ íà ÷àñòèöàõ SiO

2

. Äëÿ óäàëåíèÿ îñòàòêîâ äâóîêèñè êðåìíèÿ, îêàçûâàþ-

ùèõ íåãàòèâíûé ýôôåêò íà ôåðìåíòàòèâíûé ñèíòåç ÄÍÊ, ïîëó÷åííûé ïðåïàðàò äî-

ïîëíèòåëüíî îáðàáàòûâàëè ñèñòåìîé Wizard DNA Clean Up (Promega).

Äëÿ àìïëèôèêàöèè êîíòðîëüíîãî ðàéîíà ìòÄÍÊ èñïîëüçîâàëè ïðàéìåðû Thr

(

15898-5´-T

CAAAGCTTACACCAGTCTTGTAAACC-3

´

-15926) è TDKD (

16518-5´-

CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3´-16498

). 50 ìêë àìïëèôèêàöèîííîé ñìåñè ñîäåð-

æàëè 75 ìM Tris–HCl pH 9,0, 20 ìM (NH

4

)

2

SO

4

, 0,01 % Tween 20, 1,5 ìM MgCl

2

,

0,2 ìM dNTPs, 1 åä. Taq pol, 1,0—1,5 ìêã äðåâíåé ÄÍÊ, ïî 25 ïìîëü êàæäîãî ïðàéìå-

ðà. Ñîðîê öèêëîâ àìïëèôèêàöèè ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðèáîðà ôèðìû «ÁÈÑ»

(ïîñ. Êîëüöîâî, ã. Íîâîñèáèðñê) â ñëåäóþùåì ðåæèìå: 94 °Ñ — 3 ìèí, 1 öèêë, 94 °Ñ —

0,8 ìèí, 54 °Ñ — 1,2 ìèí, 72 °Ñ — 1,5 ìèí. Ïðîäóêòû àìïëèôèêàöèè îöåíèâàëè ïðè

ïîìîùè ýëåêòðîôîðåçà â 4%-ì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå.

Äâóõöåïî÷å÷íûé ïðîäóêò ÏÖÐ äëÿ îáðàçöîâ ¹ 1 è 2 êëîíèðîâàëè â âåêòîðå

pCR

TM

 II (Invitrogen, original TA cloning kit). Ïîëó÷åííóþ ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ ñåêâå-

íèðîâàëè íà àâòîìàòè÷åñêîì ñåêâåíàòîðå, à òàêæå îáû÷íûì ñïîñîáîì ñ èñïîëü-

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

ÃËÀÂÀ. 3. ÏÀËÅÎÃÅÍÅÒÈ×ÅÑÊÈÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß ÍÎÑÈÒÅËÅÉ ÊÓËÜÒÓÐÛ ÐÀÍÍÅÃÎ ÆÅËÅÇÍÎÃÎ ÂÅÊÀ

ÈÍÒÅÃÐÀÖÈÎÍÍÛÅ  ÏÐÎÅÊÒÛ

123

çîâàíèåì êîììåð÷åñêèõ íàáîðîâ. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü íóêëåîòèäîâ êîíòðîëüíîãî ðàé-

îíà ìòÄÍÊ îáðàçöà 3 îïðåäåëÿëàñü ïðÿìûì ñåêâåíèðîâàíèåì ïðîäóêòà àñèììåò-

ðè÷íîé ÏÖÐ.

Íà âñåõ ñòàäèÿõ âûäåëåíèÿ äðåâíåé ÄÍÊ êîíòðîëèðîâàëè íàëè÷èå ïðèìåñåé

íóêëåèíîâûõ êèñëîò èíîé ïðèðîäû (íàïðèìåð, ïðîäóêòîâ ÏÖÐ). Äëÿ êàæäîãî èíäè-

âèäà ðåçóëüòàò âîñïðîèçâîäèëñÿ äâàæäû íà ïðåïàðàòàõ ÄÍÊ, âûäåëåííûõ èç ðàçíûõ

ôðàãìåíòîâ òêàíè. Ñ öåëüþ äîïîëíèòåëüíîé âåðèôèêàöèè ïîëó÷åííûõ äàííûõ ïðî-

öåäóðà âûäåëåíèÿ ÄÍÊ è àìïëèôèêàöèè áûëà ïîëíîñòüþ âîñïðîèçâåäåíà â ëàáîðà-

òîðèè ìîëåêóëÿðíîé îíêîëîãèè Èíñòèòóòà Ïàñòåðà (ã. Ëèëëü, Ôðàíöèÿ), â êîòîðîé

ðàáîòû ñ ÄÍÊ æèòåëåé Ñåâåðíîé è Öåíòðàëüíîé Àçèè ðàíåå íå âûïîëíÿëèñü.

Ïåðâè÷íóþ ñòàòèñòè÷åñêóþ îáðàáîòêó íóêëåîòèäíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé è èõ

ãðóïïèðîâàíèå ïî ýòíè÷åñêîé ïðèíàäëåæíîñòè äëÿ ïîñëåäóþùåé îáðàáîòêè îñóùå-

ñòâëÿëè ñðåäñòâàìè ïàêåòà ïðèêëàäíûõ ïðîãðàìì SPSS 8.0. Ïîïàðíûå âíóòðè-

è ìåæïîïóëÿöèîííûå íóêëåîòèäíûå ðàçëè÷èÿ ðàññ÷èòûâàëè ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììû

PAIRPOP (Â. Í. Áàáåíêî, ÈÖèà ÑÎ ÐÀÍ) è ARLEQUIN. Ãåíåòè÷åñêèå äèñòàíöèè

ìåæäó ïàðàìè ïîïóëÿöèé ðàññ÷èòûâàëè íà îñíîâå ñðåäíèõ âíóòðè- è ìåæïîïóëÿöè-

îííûõ ïîïàðíûõ ðàçëè÷èé ïî ôîðìóëå, ïðåäëîæåííîé Ô. Êàëàôåëë ñ ñîàâòîðàìè

[12]. Äåðåâüÿ ãåíåòè÷åñêèõ ðàññòîÿíèé ñòðîèëè ñ ïîìîùüþ ïðîãðàìì NEIGHBOR,

DRAWTREE (PHYLIP 3.5).

Äîñòóïíîñòü õîðîøî ñîõðàíèâøèõñÿ ìÿãêèõ òêàíåé äðåâíèõ îñòàíêîâ ïàçûðûê-

öåâ, íåñîìíåííî, ñïîñîáñòâîâàëà óñïåøíîìó ðàçâèòèþ íàøèõ ðàáîò íà íà÷àëüíûõ

ýòàïàõ èññëåäîâàíèÿ ñ äðåâíåé ÄÍÊ. Îäíàêî àðõåîëîãè÷åñêèå íàõîäêè òàêîãî òèïà

äîñòàòî÷íî óíèêàëüíû è îðèåíòèðîâàòüñÿ íà íèõ â øèðîêîìàñøòàáíûõ ïîïóëÿöèîí-

íûõ èññëåäîâàíèÿõ íåëüçÿ. Íåîáõîäèìà áûëà ìåòîäèêà, àäàïòèðîâàííàÿ äëÿ âûäåëå-

íèÿ ÄÍÊ èç êîñòíîé òêàíè, ïðåäñòàâëåííîé îáû÷íî â äîâîëüíî áîëüøèõ êîëè÷å-

ñòâàõ ïðè àðõåîëîãè÷åñêèõ ðàñêîïêàõ. Íåñîìíåííûå òðóäíîñòè âûçûâàëî è òî îáñòî-

ÿòåëüñòâî, ÷òî èçâëå÷åííàÿ èç êîñòíîé òêàíè äðåâíèõ îñòàíêîâ ìòÄÍÊ ÿâëÿåòñÿ

â áîëüøåé ñâîåé ÷àñòè ôðàãìåíòèðîâàííîé, âñëåäñòâèå ÷åãî, êàê ïðàâèëî, âîñïðîèç-

âîäèìî àìïëèôèöèðóþòñÿ ëèøü êîðîòêèå ôðàãìåíòû ÄÍÊ. Ïîýòîìó, ÷òîáû ïðîâå-

ñòè ñåêâåíèðîâàíèå ÄÍÊ êîíòðîëüíîãî ó÷àñòêà (D-ïåòëÿ) ìèòîõîíäðèàëüíîãî ãåíî-

ìà äðåâíèõ èíäèâèäîâ, ïî ðàçìåðó ñîïîñòàâèìîãî ñ àíàëèçèðóåìûì â ñëó÷àå ìòÄÍÊ

èç ñîâðåìåííûõ ïîïóëÿöèé ÷åëîâåêà, íåîáõîäèìî îòäåëüíî àìïëèôèöèðîâàòü è ñåê-

âåíèðîâàòü ïÿòü—âîñåìü ïåðåêðûâàþùèõñÿ ôðàãìåíòîâ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé íóê-

ëåîòèäîâ.  ðåçóëüòàòå ðåçêî óâåëè÷èâàåòñÿ îáúåì ðàáîò è, êàê ñëåäñòâèå, óñèëèâàåò-

ñÿ ðèñê çàãðÿçíåíèÿ ÷óæåðîäíîé ÄÍÊ.

 ñâÿçè ñ îïèñàííûìè âûøå ñëîæíîñòÿìè ïðèìåðû ìàññîâîãî àíàëèçà äðåâíèõ

îáðàçöîâ ñ îïðåäåëåíèåì ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðû ó÷àñòêà, ñîïîñòàâèìîãî ïî ðàçìåðó

ñ àíàëèçèðóåìûì äëÿ ñîâðåìåííûõ îáðàçöîâ ÄÍÊ, â ìèðîâîé ëèòåðàòóðå êðàéíå

ðåäêè è ÿâëÿþòñÿ, ñêîðåå, èñêëþ÷åíèåì.

 òî æå âðåìÿ â ñëó÷àå èñïîëüçîâàíèÿ òàêîãî ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêîãî ìàðêå-

ðà, êàê ìòÄÍÊ, î÷åâèäíî, ÷òî äîñòàòî÷íî îáîñíîâàííûå è çíà÷èìûå ýâîëþöèîííî-

ãåíåòè÷åñêèå çàêëþ÷åíèÿ î äðåâíèõ ïîïóëÿöèÿõ ìîãóò áûòü ïîëó÷åíû òîëüêî ïðè

ìàññîâîì ñêðèíèíãå îáðàçöîâ, ñîïîñòàâèìîì ñ òàêîâûì äëÿ ñîâðåìåííûõ ýòíè÷åñ-

êèõ ãðóïï. Íè îäíà èç ïðèìåíÿåìûõ íà ïðàêòèêå ìåòîäèê âûäåëåíèÿ äðåâíåé ÄÍÊ

íå ãàðàíòèðóåò äîëæíîãî êà÷åñòâà åå ïîëó÷åíèÿ â êàæäîì êîíêðåòíîì ñëó÷àå. Îñíîâ-

íûå ïðè÷èíû òàêîé íåïðåäñêàçóåìîñòè îáóñëîâëåíû ðàçíîé ñòåïåíüþ äåãðàäàöèè

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

124

ÈÍÒÅÃÐÀÖÈÎÍÍÛÅ  ÏÐÎÅÊÒÛ

ÍÀÑÅËÅÍÈÅ ÃÎÐÍÎÃÎ ÀËÒÀß Â ÝÏÎÕÓ ÐÀÍÍÅÃÎ ÆÅËÅÇÍÎÃÎ ÂÅÊÀ ÊÀÊ ÝÒÍÎÊÓËÜÒÓÐÍÛÉ ÔÅÍÎÌÅÍ

ÄÍÊ â îáðàçöàõ è ðàçëè÷èåì ñîñòàâà ñîïóòñòâóþùèõ èíãèáèòîðîâ ÏÖÐ, êîòîðûå

îïðåäåëÿþòñÿ, ãëàâíûì îáðàçîì, óñëîâèÿìè õðàíåíèÿ îñòàíêîâ.

 çàâèñèìîñòè îò ñòåïåíè ñîõðàííîñòè äðåâíåãî ìàòåðèàëà, ñîäåðæàíèå âûñî-

êîìîëåêóëÿðíîé ÄÍÊ â ïîëó÷åííûõ ïðåïàðàòàõ ìîæåò âàðüèðîâàòü â øèðîêèõ ïðå-

äåëàõ äî ïîëíîãî èõ îòñóòñòâèÿ. Ïåðâè÷íàÿ ñòðóêòóðà ÄÍÊ ìîæåò áûòü èçìåíåíà

ëîêàëüíî èëè êëàñòåðíî: âîçìîæíû äåïóðèíèçàöèÿ è äåïèðèìèäèíèçàöèÿ îñíîâà-

íèé, èõ ìîäèôèêàöèÿ, ñøèâêè ìåæäó íóêëåîòèäàìè. Íàèáîëüøèå ïîìåõè ïðèâíîñÿò

ðàçëè÷íûå ïî ìåõàíèçìó äåéñòâèÿ èíãèáèòîðû ÏÖÐ, ïðèñóòñòâóþùèå â âèäå ïðèìå-

ñåé â îáðàçöàõ ÄÍÊ. Òî÷íàÿ ïðèðîäà èíãèáèòîðîâ â íàñòîÿùåå âðåìÿ íå èçâåñòíà è,

ñîîòâåòñòâåííî, íå ñóùåñòâóåò ñòàíäàðòíûõ âûñîêîýôôåêòèâíûõ ìåòîäîâ èõ óäàëå-

íèÿ. Ó÷èòûâàÿ âñå ïåðå÷èñëåííûå îáñòîÿòåëüñòâà, ñîâåðøåííî î÷åâèäíî, ÷òî ðàçðà-

áîòêà è óñîâåðøåíñòâîâàíèå òåõíîëîãèé âûäåëåíèÿ äðåâíåé ÄÍÊ ÿâëÿåòñÿ êëþ÷å-

âûì çâåíîì ðàçâèòèÿ ïàëåîãåíåòè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé è íåîáõîäèìûì óñëîâèåì

âûõîäà íà óðîâåíü ìàññîâîãî àíàëèçà.

Ì

ÅÒÎÄÛ

ÈÇÂËÅ×ÅÍÈß

 ÄÍÊ 

ÈÇ

ÄÐÅÂÍÈÕ

ÎÑÒÀÍÊÎÂ

Ìåòîä 1. 

Îñíîâàí íà ýêñòðàêöèè èç ðàñòâîðà òîòàëüíîé ÄÍÊ ôðàãìåíòîâ ñ îï-

ðåäåëåííîé íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ ïóòåì èõ èçáèðàòåëüíîãî ñâÿçûâà-

íèÿ ñ èììîáèëèçîâàííûìè îëèãîíóêëåîòèäàìè. Â èññëåäîâàíèÿõ èñïîëüçîâàëè áèî-

òèíèëèðîâàííûå îëèãîíóêëåîòèäíûå ïðàéìåðû, èììîáèëèçîâàííûå íà ñòðåïòîâè-

äèíå, çàêðåïëåííîì íà ïîâåðõíîñòè ïîëèìåðíîé îáîëî÷êè, ïîêðûâàþùåé ïàðà-

ìàãíèòíûå ÷àñòèöû.  ýêñïåðèìåíòàõ èñïîëüçîâàëè ïðåïàðàòû Dynabeads DNA Direct

ôèðìû «Dynal». Ïðèìåíåíèå èììîáèëèçàöèè íà ïàðàìàãíèòíûõ ÷àñòèöàõ ïîçâîëÿ-

åò ñóùåñòâåííî óïðîñòèòü è óñêîðèòü âñå ïðîöåññû î÷èñòêè è ðàçäåëåíèÿ êîìïîíåí-

òîâ ðàñòâîðîâ. Îñíîâíûå ýòàïû ìåòîäèêè âêëþ÷àþò: 1) ïîëó÷åíèå ðàñòâîðà ÄÍÊ;

2) äåíàòóðàöèþ òîòàëüíîé ÄÍÊ; 3) äîáàâëåíèå ê ðàñòâîðó ÄÍÊ áèîòèíèëèðîâàííîãî

îëèãîíóêëåîòèäíîãî ïðàéìåðà è åãî îòæèã ñ ôðàãìåíòàìè ÄÍÊ, ñîäåðæàùèìè êîìï-

ëåìåíòàðíûå ïðàéìåðó ïîñëåäîâàòåëüíîñòè; 4) äîáàâëåíèå ê ðàñòâîðó ñòðåïòîâèäè-

íà, èììîáèëèçîâàííîãî íà ïàðàìàãíèòíûõ ÷àñòèöàõ, ïîëó÷åíèå êîìïëåêñà ìåæäó

áèîòèíîì, ðàñïîëîæåííûì íà 5

´

-êîíöå ïðàéìåðà, è ñòðåïòîâèäèíîì; 5) ôîðìèðî-

âàíèå êîìïëåêñà ìåæäó îäíîöåïî÷å÷íîé ÄÍÊ â ðàñòâîðå è îëèãîíóêëåîòèäíûì ïðàé-

ìåðîì íà ïàðàìàãíèòíûõ ÷àñòèöàõ; 6) îñàæäåíèå ïàðàìàãíèòíûõ ÷àñòèö ñî ñâÿçàí-

íîé ÄÍÊ íà ñòåíêè ïðîáèðêè â ìàãíèòíîì ïîëå; 7) äèññîöèàöèÿ äâóõöåïî÷å÷íîé

ÄÍÊ, çàêðåïëåííîé íà ïàðàìàãíèòíûõ ÷àñòèöàõ íàãðåâàíèåì èëè äîáàâëåíèåì ùå-

ëî÷è, è îñàæäåíèå ïàðàìàãíèòíûõ ÷àñòèö ñ îäíîöåïî÷å÷íûì îëèãîíóêëåîòèäîì

â ìàãíèòíîì ïîëå. Äàëåå ÄÍÊ, íàõîäÿùàÿñÿ â ðàñòâîðå, èñïîëüçóåòñÿ â êà÷åñòâå èñ-

õîäíîé ìàòðèöû â ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè. Îäíàêî âûäåëåííàÿ è î÷èùåííàÿ

öåëåâàÿ ÄÍÊ ÷àñòî áûâàåò ïîäâåðæåíà ÷ðåçâû÷àéíî áûñòðîé äåãðàäàöèè â ðàñòâî-

ðå. Äëÿ ïîâûøåíèÿ óñòîé÷èâîñòè ïðåïàðàòà ÄÍÊ ýêñïåðèìåíòàëüíî ïîäáèðàþòñÿ

ñïåöèôè÷åñêèå äîáàâêè, ñóùåñòâåííî ïîâûøàþùèå ñðîêè åå ñîõðàííîñòè.

Ïðåäëàãàåìûé ìåòîä èìååò ðÿä î÷åâèäíûõ ïðåèìóùåñòâ, ïî ñðàâíåíèþ ñ ñóùå-

ñòâóþùèìè ìåòîäàìè âûäåëåíèÿ äðåâíåé ÄÍÊ. Ñðåäè íèõ:

1. Âîçìîæíîñòü èçâëå÷åíèÿ äî íåîáõîäèìûõ êîíöåíòðàöèé òðåáóþùåãîñÿ ôðàã-

ìåíòà ÄÍÊ áëàãîäàðÿ îòñóòñòâèþ îãðàíè÷åíèé â êîëè÷åñòâå ïåðåðàáàòûâàåìîé òêàíè.

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

ÃËÀÂÀ. 3. ÏÀËÅÎÃÅÍÅÒÈ×ÅÑÊÈÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß ÍÎÑÈÒÅËÅÉ ÊÓËÜÒÓÐÛ ÐÀÍÍÅÃÎ ÆÅËÅÇÍÎÃÎ ÂÅÊÀ

ÈÍÒÅÃÐÀÖÈÎÍÍÛÅ  ÏÐÎÅÊÒÛ

125

2. Âîçìîæíîñòü ñåëåêòèâíîãî âûäåëåíèÿ òîëüêî ïîëíîðàçìåðíîãî ôðàãìåíòà ÄÍÊ

ïóòåì ïîäáîðà ñïåöèôè÷åñêèõ ïðàéìåðîâ ê êàæäîé èç öåïåé â ó÷àñòêàõ, ôëàíêèðóþ-

ùèõ ëîêóñ ñ äâóõ ñòîðîí.

3. Îñâîáîæäåíèå ðàñòâîðà îò ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ, íå ïðåäñòàâëÿþùèõ èíòåðåñ

â êîíêðåòíîì èññëåäîâàíèè è ñîñòàâëÿþùèõ îñíîâíóþ ÷àñòü ïðåïàðàòà ÄÍÊ, èñ-

ïîëüçóþùåãîñÿ äëÿ ÏÖÐ ïðè òðàäèöèîííûõ ïîäõîäàõ. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ ýêñïåðè-

ìåíòàëüíî óñòàíîâëåíî, ÷òî ïðè àìïëèôèêàöèè íèçêîêîïèéíûõ ìàòðèö íåñïåöèôè-

÷åñêîå ñâÿçûâàíèå ïðàéìåðîâ ñ ðàçëè÷íûìè ïðèìåñíûìè ôðàãìåíòàìè ÄÍÊ â ðà-

ñòâîðå ÿâëÿåòñÿ îñíîâíûì ôàêòîðîì, ðåçêî ñíèæàþùèì ýôôåêòèâíîñòü àìïëèôèêà-

öèè öåëåâîãî ôðàãìåíòà.  ñâÿçè ñ ýòèì âîçìîæíîñòü èçâëå÷åíèÿ è êîíöåíòðèðîâà-

íèÿ èç ãåòåðîãåííîé ñìåñè ãåíîìíîé ÄÍÊ ëèøü òåõ ìîëåêóë, êîòîðûå òðåáóþòñÿ äëÿ

àíàëèçà, ïîçâîëÿåò êàðäèíàëüíî ðåøèòü ïðîáëåìó ýôôåêòèâíîãî ïðîâåäåíèÿ ÏÖÐ.

4. Ñåëåêòèâíîå óäàëåíèå öåëåâîé ÄÍÊ èç ïåðâè÷íîãî ðàñòâîðà ïîçâîëÿåò â äàëü-

íåéøåì ýôôåêòèâíî èçáàâëÿòüñÿ îò ïðèñóòñòâóþùèõ â íåì êîìïîíåíòîâ, èíãèáèðó-

þùèõ ïîëèìåðàçíóþ öåïíóþ ðåàêöèþ â ñëó÷àå ýêñòðàêöèè ÄÍÊ èç àðõåîëîãè÷åñêèõ

îáðàçöîâ.

Òàêèì îáðàçîì, ðåàëèçàöèÿ íîâîãî ìåòîäà âûäåëåíèÿ ÄÍÊ ñîçäàåò ïðåäïîñûë-

êè äëÿ ôîðìèðîâàíèÿ ðàñøèðåííîé áàçû îáðàçöîâ äðåâíåé ÄÍÊ èç âñåõ äîñòóïíûõ

áèîëîãè÷åñêèõ ìàòåðèàëîâ. Ñðåäè ìíîãèõ ôàêòîðîâ, îñëîæíÿþùèõ ðàáîòó ñ äðåâíè-

ìè îáðàçöàìè ÄÍÊ, íàèáîëüøåé íåïðåäñêàçóåìîñòüþ îòëè÷àþòñÿ òàê íàçûâàåìûå

êîíòàìèíèðóþùèå ïðîäóêòû ÏÖÐ. Äëÿ èõ óñòðàíåíèÿ êîìïîíåíòû ðåàêöèîííûõ ñìå-

ñåé, èñïîëüçóåìûå äëÿ ïðîâåäåíèÿ ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè, ïîäâåðãàþò îáðà-

áîòêå ôåðìåíòàìè ðåñòðèêöèè. Â áîëüøîé ñåðèè ýêñïåðèìåíòîâ ïîêàçàíî, ÷òî ïî-

äîáíàÿ îáðàáîòêà íàäåæíî î÷èùàåò êîìïîíåíòû ðåàêöèîííîé ñìåñè êàê îò íåæåëà-

òåëüíûõ ïðèìåñåé ÷óæåðîäíîé ÄÍÊ, òàê è îò ïðèìåñíûõ ÏÖÐ-ïðîäóêòîâ.

Âûäåëåíèå òîòàëüíîé ÄÍÊ èç êîñòè ñ èñïîëüçîâàíèåì ãóàíèäèíòèîöèîíàòà

.

Íà íà÷àëüíîì ýòàïå êîñòíûå ïðåïàðàòû ñ áîëüøèì ñîäåðæàíèåì ãóá÷àòîé êîñòè ðàç-

ìàëûâàëè â ìåëêîäèñïåðñíûé ïîðîøîê. Öåëûé ïðåïàðàò êîñòè ïðåäâàðèòåëüíî îá-

æèãàëè â ïëàìåíè ñïèðòîâêè ñíàðóæè è äëèòåëüíî îáëó÷àëè óëüòðàôèîëåòîì. Äàëåå

òîòàëüíóþ ÄÍÊ èçâëåêàëè èç êîñòè ñ ïîìîùüþ îäíîé èç ñëåäóþùèõ ìåòîäèê.

Íà 1 ã êîñòè áðàëè 4 ìë ýêñòðàêöèîííîãî áóôåðà (4 Ì ãóàíèäèíòèîöèîíàò; 0,1 Ì

NaCl; 0,014 Ì 

b

-ìåðêàïòîýòàíîë; 0,025 Ì ÝÄÒÀ; 0,5%-é SDS) è èíêóáèðîâàëè 12 ÷

ïðè 60 °Ñ è ïîñòîÿííîì ïåðåìåøèâàíèè. Äàëåå ïóòåì öåíòðèôóãèðîâàíèÿ (12 000 îá.,

5 ìèí) îòáèðàëè ñóïåðíàòàíò è îñàæäàëè åãî òàêèì æå îáúåìîì ÏÝÃ (20%-é ÏÝÃ6000

â 2,5 Ì NaCl): èíêóáèðîâàëè 1 ÷ ïðè 37 °Ñ ñ ïîñëåäóþùèì öåíòðèôóãèðîâàíèåì è

äâóõêðàòíîé îòìûâêîé îñàäêà 80%-ì ýòàíîëîì. Ðàñòâîðÿëè â 60 ìêë H

2

O.

Âûäåëåíèå òîòàëüíîé ÄÍÊ èç êîñòè ñ èñïîëüçîâàíèåì êîëëàãåíàçû è ïðîòåèíà-

çû. 

Íà 1 ã êîñòè áðàëè 10 ìë ëèçèðóþùåãî áóôåðà (100 ìÌ òðèñ-HCl (pH 8); 2 ìÌ

ÝÄÒÀ; 10 ìÌ NaCl), ïî 5 ìã ñóõîé êîëëàãåíàçû è ñóõîé ïðîòåèíàçû è èíêóáèðîâàëè â

òå÷åíèå ñóòîê ïðè 37 °Ñ. Äàëåå ïðîâîäèëè äâóõêðàòíóþ î÷èñòêó ïîëó÷èâøåãîñÿ ñóïåð-

íàòàíòà ôåíîëîì, ôåíîë/õëîðîôîðìîì è õëîðîôîðìîì. ÄÍÊ èç ñóïåðíàòàíòà îñàæäà-

ëè èçîïðîïàíîëîì ñ ïîñëåäóþùåé ïðîìûâêîé îñàäêà 80%-ì ýòàíîëîì.

Âûäåëåíèå ìèòîõîíäðèàëüíîé ÄÍÊ èç ïóëà òîòàëüíîé ÄÍÊ ñ èñïîëüçîâàíèåì

ìàãíèòíûõ ÷àñòèö. 

Ïðîâîäèòñÿ â äâà ýòàïà.

1. Îòæèã ìèòîõîíäðèàëüíîé ÄÍÊ ñ áèîòèíèëèðîâàííûì ïðàéìåðîì (5

´-

á

-

ACTCC

ÑÑ

ACCATTAGCACCCAAA-3´

), âçÿòîãî â êîíöåíòðàöèè 50 íÌ, ïðîâîäèëè

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»