Файл: ГФ 11-2.pdf

             _

 
 

             d  = (18,61 + 18,3 + 18,12) / 3 = 18,34;

 
 

              S

 
 

             _

 
 

             d  = (18,44 + 18,1 + 18,3) / 3 = 18,28;

 
 

              U

lg С = 0,6990 + (18,28 - 18,34) / 6,532 = 0,6990 - 0,0092 = 0,6898;

 
 

    U

 
 

                  C  = antilg (0,6898) = 4,896;

 
 

                   U

 
 

                     А  = 4,896 х 160 = 783.

 
 

                      U

Поскольку микробиологическое исследование активности антибиотиков подвержено 

вариабельности, следует проводить не менее 6 повторных испытаний в разные дни (не менее 2 

дней), так как средняя активность отдельных определений, проведенных в разные дни, - более 

надежная величина, чем средняя активность, полученная в результате такого же количества 

определений, проведенных одновременно. 

 
 

Расчет ошибки определения логарифма концентрации испытуемого образца в пределах одного 

опыта приведен в приложении 1 к настоящей статье. Объединение результатов отдельных опытов 

проводят в соответствии с формулами, приведенными в приложении 2 к настоящей статье. 

 
 

Во всех сомнительных случаях и при определении активности стандартных образцов должен 

использоваться только трехдозный вариант метода диффузии в агар. 

 
 

Для определения содержания активного вещества во флаконе активность, найденную в 1 мг, 

умножают на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах. При исследовании 

раствора, приготовленного из всего содержимого флакона или ампулы, активность, найденную в 1 

мл этого раствора, умножают на его объем. В случае необходимости определения содержания 

активного вещества в 1 мг испытуемого образца следует величину, характеризующую содержание 

активного вещества во флаконе, разделить на массу содержимого флакона, выраженную в 

миллиграммах. 

 
 

При определении содержания активного вещества в таблетках или капсулах их количество, а 

также подготовка для анализа должны соответствовать требованиям общих статей ГФ XI издания 

"Таблетки" (с. 154) и "Капсулы" (с. 143). В дальнейшем основной раствор испытуемого образца 

готовят из расчета 1 мг в 1 мл. После перемешивания раствору дают отстояться или центрифугируют. 

Рабочий раствор испытуемого образца готовят разведением надосадочной жидкости основного 

раствора. Для определения содержания активного вещества в 1 таблетке или капсуле активность 1 мг 

порошка растертых таблеток или содержимого капсул умножают на среднюю массу таблетки или 

содержимого капсулы, выраженную в миллиграммах. 

 
 

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей

Приладожья, Поморья и Прионежья –   

www.alppp.ru.

 Постоянно действующий третейский суд. 

При исследовании таблеток, покрытых оболочкой, активность определяют в нескольких 

растворенных таблетках, количество которых и растворитель должны быть указаны в частных 

статьях. Активность, найденную в 1 мл основного раствора, умножают на его объем и делят на 

количество растворенных в этом объеме таблеток. 

 
 

Выращивание и хранение культур тест - микробов <*>. Все культуры тест - микробов сохраняют 

в запаянных пробирках на соответствующих плотных питательных средах в течение 15-30 сут при 

температуре от 4 до 10 град. С, после чего пересеивают на свежую питательную среду. Тест - 

микробы можно сохранять и в лиофилизированном состоянии. 

 
 

--------------------------------

 
 

<*> Штаммы тест - микробов, за исключением Candida utilis ЛИА-01, применяемые для 

определения антимикробной активности антибиотиков, хранятся в музее патогенных и условно 

патогенных культур при Государственном научно - исследовательском институте стандартизации и 

контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Candida utilis ЛИА-01 

хранится во Всесоюзном научно - исследовательском технологическом институте антибиотиков и 

ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ). 

Для характеристики культурных свойств микроорганизмов (см. табл. 18) производится их высев 

в пробирки с мясо - пептонным бульоном (МПБ), затем через 18-20 ч инкубации при температуре (36 

+/-1) град. С культуры высеивают на чашки Петри с плотной средой для выделения типичных 

колоний, которые затем пересевают на соответствующие питательные среды для получения в 

дальнейшем взвесей вегетативных клеток или спор. Взвесь хранят в запаянных стеклянных пробирках 

при температуре от 4 до 10 град. С в течение определенного срока. 

 
 

В полученной взвеси определяют концентрацию клеток (спор) по оптическому стандарту 

мутности <*> или нефелометрически (основная взвесь). Из этой взвеси по мере надобности готовят 

рабочую взвесь в соответствии с посевной дозой, предусмотренной для каждого тест - микроба (см. 

табл. 17). 

 
 

--------------------------------

 
 

<*> Оптические стандарты мутности и инструкция по их использованию выпускаются и 

рассылаются Государственным научно - исследовательским институтом стандартизации и контроля 

медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. 

Культуру тест - микроба Staphylococcus aureus 209P высевают на чашки Петри со средой N 1 и 

после выращивания в течение 18-20 ч при (364 +/-1) град. С оставляют при комнатной температуре 

на 24 ч для наблюдения за образованием пигмента. Отбирают типичные колонии и пересевают их в 

пробирки со скошенным агаром того же состава. 

 
 

Для определения активности используют взвесь 18-20-часовой культуры стафилококка, 

выращенной в пробирке на скошенном агаре. Возможно также применение в течение длительного 

времени взвеси культуры, полученной следующим образом: культуру выращивают в течение 18-20 ч 

на скошенном агаре в пробирке, смывают ее 5-10 мл стерильного раствора хлорида натрия 

изотонического 0,9%. Полученной взвесью засевают матрац с 300 мл среды N 1 (со скошенной 

поверхностью), выращивают в течение 2 сут [сутки при (36 +/-1) град. С и сутки при комнатной 

температуре], смывают примерно 50 мл стерильного раствора хлорида натрия изотонического 0,9%. 

Взвесь культуры можно хранить в запаянных пробирках в течение 5-7 нед при температуре от 4 до 10 

 
 

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей

Приладожья, Поморья и Прионежья –   

www.alppp.ru.

 Постоянно действующий третейский суд. 

град. С. 

 
 

Культуру тест - микроба Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617 гладкая форма) выращивают так же, 

как указано для Staphylococcus aureus 209P, за исключением времени инкубации, которое составляет 

для Bordetella bronchiseptica 30-36 ч. Посевным материалом служит культура, выращенная в пробирках 

со скошенным агаром и хранящаяся при температуре от 4 до 10 град. С не более 2 нед. Для 

длительного применения взвеси клеток культуру смывают с питательной среды 5-10 мл стерильного 

раствора натрия хлорида изотонического 0,9%, засевают матрац со средой N 1 (со скошенной 

поверхностью) и далее поступают так же, как при подготовке культуры Staphylococcus aureus 209P. 

Взвесь клеток Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 может храниться в течение 7 сут. 

 
 

Культуру тест - микроба Pseudomonas aeruginosa N CTC 2134 выращивают на чашках Петри со 

средой N 1 в течение 18-20 ч при температуре (36 +/-1) град. С, отбирают типичные колонии, 

пересевают их на мясо - пептонный бульон рН от 7,2 до 7,4 и выращивают в вышеуказанных 

условиях. Полученная культура служит посевным материалом для приготовления суточной культуры, 

используемой при определении активности в каждом конкретном опыте, и может храниться в 

течение 30 сут при температуре от 4 до 10 град. С. 

 
 

Культуру тест - микроба Candida utilis ЛИА-01 выращивают на чашках Петри со средой N 3 в 

течение 48 ч при температуре (30 +/-1) град. С, отбирают типичные колонии, пересевают их в 

пробирки со скошенным агаром того же состава и выращивают в указанных выше условиях. 

Полученная культура служит посевным материалом для приготовления взвеси клеток, применяемой в 

течение длительного времени. Для этого культуру с поверхности среды смывают 5-10 мл стерильного 

раствора натрия хлорида изотонического 0,9% и засевают матрац с 300 мл среды N 3 (со скошенной 

поверхностью). Через 2 сут культуру смывают 50 мл стерильного раствора натрия хлорида 

изотонического 0,9%. По мере надобности готовят рабочую взвесь, густота которой должна быть 

такой, чтобы при разведении ее в 30 раз 0,9% раствором натрия хлорида изотонического оптическая 

плотность составляла 0,22-0,23. Для определения густоты взвеси используют нефелометр с 

нейтральным светофильтром и кюветы с толщиной слоя 3 мм. Рабочая взвесь может храниться в 

течение 30 сут. 

 
 

При использовании спорообразующих культур тест - микробов процесс выращивания на чашках 

Петри, отбор типичных колоний, пересев на пробирки со скошенным агаром и на матрацы 

осуществляют так же, как указано для Staphylococcus aureus 209P. 

 
 

Для выращивания культур тест - микробов Вас. subtilis, var. Л2 и Вас. pumilus N CTC 8241 на 

чашках Петри и пробирках используют среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 4; для 

выращивания культур тест - микробов Вас. cereus, var. mycoides HB и Вас. subtilis ATCC 6633 на чашках 

Петри и пробирках используют среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 5; для 

выращивания культуры тест - микроба Вас. cereus, var. mycoides 537 на чашках Петри и на пробирках 

используют среду N 2, при выращивании на матрацах - среду N 4. 

 
 

Для получения взвеси спор культуру, выращенную в пробирках, смывают 5-10 мл стерильного 

раствора натрия хлорида изотонического 0,9%, засевают ею несколько матрацев с 300 мл 

питательной среды (со скошенной поверхностью) и выращивают в течение 5-7 сут. В процессе 

выращивания периодически производят микроскопический контроль культуры, и если в мазках, 

окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 80-90% спор, производят смыв стерильной 

дистиллированной водой. 

 
 

Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до 70 град. С в течение 30 мин. 

Затем промывают стерильной дистиллированной водой при центрифугировании до полной 

прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор вновь прогревают в течение 30 мин 

при температуре от 60 до 70 град. С. Взвесь спор хранят в запаянных стеклянных пробирках при 

 
 

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей

Приладожья, Поморья и Прионежья –   

www.alppp.ru.

 Постоянно действующий третейский суд. 

температуре от 4 до 10 град. С и используют до тех пор, пока интенсивность роста и четкость зон при 

определении антимикробной активности препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям. 

 
 

Для заражения питательных сред допускается использование лиофилизированных тест - культур 

с точно известным содержанием количества микробных клеток (спор) в ампуле, которые после 

суспендирования в соответствующем растворителе (растворе натрия хлорида изотонического 0,9% 

или дистиллированной воде) вносят в питательную среду без предварительного пересева. 

 
 

Питательные среды и буферные растворы. В табл. 19 представлен состав сред, используемых 

при определении активности антибиотиков. 

 
 

Для приготовления сред N 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16 применяют ферментативный 

гидролизат биомассы микроорганизмов без оболочек. Методика приготовления состоит в следующем: 

5 г сухого ферментативного гидролизата размешивают в 1 л дистиллированной воды, прибавляют 

агар - агар, расплавленный в открытом котле или автоклаве текучим паром или под давлением 0,05 

МПа и температуре (111 +/- 1) град. С в течение 30 мин. В случае необходимости в среду прибавляют 

соли в количестве, указанном в прописи сред; рН сред определяют потенциометрически со 

стеклянными электродами или колориметрически. Реакцию среды (рН) корригируют 

хлористоводородной кислотой или раствором едкого натрия. 

 
 

Готовые среды разливают в соответствующую посуду и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа и 

температуре (120 +/- 1) град. С в течение 15 мин. 

Таблица 19 

Состав питательных сред для выращивания

 
 

тест - культур, получения спор и

 
 

определения активности антибиотиков

-----------------T------------------------------------------------¬

 
 

¦

                

¦

                Номера сред                     

¦

 
 

¦

  Ингредиенты   

+-------T-------T-------T-------T-------T--------+

 
 

¦

                

¦

   1   

¦

   2   

¦

   3   

¦

   4   

¦

   5   

¦

   6    

¦

 
 

+----------------+-------+-------+-------+-------+-------+--------+

 
 

¦

                 Содержание каждого ингредиента                  

¦

 
 

+----------------T-------T-------T-------T-------T-------T--------+

 
 

¦

Мясо - пептонный

¦

1000 мл

¦

1000 мл

¦

1000 мл

¦

  5 г  

¦

  5 г  

¦

  5 г   

¦

 
 

¦

бульон 1:2      

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Ферментативный  

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

гидролизат  био-

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей

Приладожья, Поморья и Прионежья –   

www.alppp.ru.

 Постоянно действующий третейский суд. 

¦

массы микроорга-

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

низмов без  обо-

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

лочек           

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Агар - агар     

¦

 20 г  

¦

 20 г  

¦

 17 г  

¦

 25 г  

¦

 25 г  

¦

 10-15 г

¦

 
 

¦

Глюкоза         

¦

       

¦

       

¦

 10 г  

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Натрия фосфат   

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

двузамещенный   

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Калия фосфат    

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

однозамещенный  

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Натрия хлорид   

¦

       

¦

       

¦

  5 г  

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Калия хлорид    

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Мочевина        

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Аммония цитрат  

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

двузамещенный   

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Аммония хлорид  

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Вода            

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

дистиллированная

¦

       

¦

       

¦

       

¦

1000 мл

¦

1000 мл

¦

1000 мл 

¦

 
 

¦

рН после        

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

стерилизации    

¦

7,0-7,2

¦

7,8-8,0

¦

7,0-7,2

¦

6,0-6,2

¦

7,8-8,0

¦

6,8-7,0 

¦

 
 

L----------------+-------+-------+-------+-------+-------+---------

    Продолжение

 
 

-----------------T------------------------------------------------¬

 
 

¦

                

¦

                Номера сред                     

¦

 
 

¦

  Ингредиенты   

+-------T-------T-------T-------T-------T--------+

 
 

¦

                

¦

   7   

¦

   8   

¦

   9   

¦

  10   

¦

  11   

¦

  12    

¦

 
 

+----------------+-------+-------+-------+-------+-------+--------+

 
 

¦

                 Содержание каждого ингредиента                  

¦

 
 

+----------------T-------T-------T-------T-------T-------T--------+

 
 

¦

Мясо - пептонный

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

бульон 1:2      

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

       

¦

        

¦

 
 

¦

Ферментативный  

¦

  5 г  

¦

  5 г  

¦

  5 г  

¦

  5 г  

¦

       

¦

        

¦

 
 

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей