Файл: Знакомство с микробиологической лабораторией и правилами работы в ней.pdf

Астраханский ГМУ
ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ
Минздрава России
Кафедра микробиологии вирусологии
Тема: Знакомство с микробиологической лабораторией и правилами работы в ней.
Техника приготовления микропрепаратов. Простой метод окраски.
Микроскопия с иммерсией.
Вопросы для обсуждения:
1. Назначение микробиологических лабораторий.
2. Правила техники безопасности при работе в бактериологической лаборатории.
3. Аппаратура для микробиологических исследований.
4. Оснащение рабочего места студента.
5. Иммерсионная система микроскопа.
6. Техника приготовления микропрепарата с агаровой культуры бактерий. Простой метод окраски.
Микробиологические лаборатории организуются при больницах или входить в состав учреждений Госсанэпидемнадзора. Микробиологические лаборатории занимаются бактериологической диагностикой инфекционных заболеваний, исследуя патологический материал с целью обнаружения патогенных микроорганизмов – возбудителей заболевания.
В зависимости от назначения выделяют следующие лаборатории: бактериологические, паразитологические, микологические, иммунологические, вирусологические и специальные (для диагностики особо опасных инфекций).
Для микробиологической лаборатории обычно отводится специальное помещение, состоящее из комплекса комнат, разделяющегося на «чистую» и «заразную» зоны.
В «чистой» зоне располагаются: комната для верхней одежды, помещения для проведения подготовительных работ (препараторская, моечная, средоварочная), стерилизационная, комната с холодильной камерой или холодильниками для хранения питательных сред и диагностических препаратов, комната отдыха и приема пищи, комната для надевания рабочей одежды, комната для работы с документацией и литературой, кабинет заведующего, подсобные помещения.

Астраханский ГМУ
В «заразной» зоне располагаются: комната для приема и регистрации материала, боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности, термостатная комната, автоклавная для обеззараживания и профильные комнаты, в которых осуществляются бактериологические, серологические, гельминтологические, и прочие работы.
Назначение некоторых комнат микробиологической лаборатории:
- препараторская комната является местом работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к проведению микробиологического анализа;
- средоварочная комната предназначена для приготовления питательных сред; в ней допускается размещать автоклав для их стерилизации;
- моечная комната обеспечена холодной и горячей водой и необходима для подготовки посуды к стерилизации;
- автоклавная комната служит для обеззараживания и стерилизации, в ней размещают стерилизующее оборудование: автоклавы и сушильные шкафы. Стерилизации подвергают питательные среды и инструменты, а обеззараживанию – отработанный инфицированный материал;
- бокс-комната используется для пересева культур микроорганизмов и требует стерильных условий. Качественная стерилизация бокса достигается применением бактерицидной лампы. Бокс оборудуется предбоксником, служащим шлюзом для перехода из стерильной зоны в общую;
-
термостатная
комната предназначена для культивирования микроорганизмов.
В микробиологических лабораториях размещают специализированное оборудование, которое позволяет осуществлять весь цикл работ по обеспечению запланированного микробиологического анализа, направленного на тестирование самых разнообразных материалов.
В лабораторных комнатах находится специальное оборудование: термостат, холодильник, шкафы, центрифуга и др.
Все помещения лаборатории должны быть достаточно высокими, комнаты – непроходными, обеспечены водопроводом, канализацией, электроэнергией. Стены должны быть окрашены светлой масляной краской или облицованы кафелем, полы покрыты линолеумом.
Персонал во время работы должен соблюдать правила техники безопасности:

Астраханский ГМУ

Обязательно постоянное ношение в лаборатории специальной одежды и обуви.

В помещении лаборатории нельзя курить и принимать пищу.

Поддержание чистоты и порядка.

Обеззараживание всех инфицированных объектов перед выбросом или повторным использованием.

Соблюдение осторожности при работе с открытым пламенем горелки.

Немедленное сообщение руководителю лаборатории обо всех аварийных ситуациях, создающих угрозу биологической безопасности.
Аппаратура для микробиологических исследований.

Термостат – аппарат для выращивания микробов. В нем поддерживается постоянная температура, как правило, 37 0
С (оптимальная для большинства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов). Термостаты бывают водяными и суховоздушными.

Анаэростаты – аппараты для выращивания микробов в бескислородных условиях.

Суховоздушный стерилизатор (печь Пастера)- металлический шкаф с двойными стенками, теплоизоляцией, электронагревателем и терморегулятором. Служит для стерилизации стеклянных, металлических и фарфоровых изделий.

Паровой стерилизатор – для стерилизации паром под давлением питательных сред, перевязочного материала, воды, а также для обеззараживания отработанных посевов.

Холодильники – для хранения музейных культур микробов, питательных сред, вакцин, сыворроток.

Центрифуги – для осаждения микробных клеток, разделения на фракции их дезинтегрантов.

Приборы для стерилизации фильтрованием: свеча Шамберлана, фильтр Зейтца.

Микроскопы – биологический, люминесцентный.
Оборудование рабочего места студента.
1. Бактериологическая посуда: бактериологическая петля, чашки Петри, пробирки, колбы, пипетки. Бактериологическая петля служит для забора микробного

Астраханский ГМУ материала и изготавливается из нихромовой или платиновой проволоки длиной 8-
10 см, один конец которой загнут в виде круга или овала.
Чашки Петри, пробирки и колбы служат для выращивания микробов на питательных средах. Перед работой вся посуда стерилизуется, причем пробирки, колбы закрывают пробками. Верхний конец пипетки должен быть закрыт ватой, а при работе с заразным материалом на него надевают маленькую грушу. По возможности нужно пользоваться автоматическими пипетками.
2. Предметные и покровные стекла. Стекла с лунками. Спиртовка. Карандаши по стеклу или специальные маркеры. Предметные стекла должны быть чисто вымыты и обезжирены, служат для приготовления микропрепаратов. Покровное стекла используют для приготовления микропрепаратов. Покровные стекла используют для приготовления раздавленной и висячей капли. Стекла с луночками необходимы для изучения живых микробов методом висячей капли. Спиртовка нужна для стерилизации в пламени бактериальных петель и некоторых других инструментов, а также для фиксации мазков и обжигания (фламбирования) краев пробирок. Посев микробного материала на питательные среды, приготовление мазков проводится у пламени спиртовки. Карандаш по стеклу или маркер необходим для надписей на стеклянной посуде.
3. Набор для приготовления мазков: изотонический раствор хлористого натрия, разведенный фуксин, раствор метиленовой сини, карболовый фуксин, полоски бумаги, пропитанные спиртовым раствором кристаллвиолета, раствор Люголя.
4. Иммерсионное масло, лучше всего, кедровое, для создания однородной оптической среды между фронтальной линзой объектива микроскопа и микропрепаратом.
5. Прочее оборудование: штатив для пробирок и петель, мостик для стекол, промыватель с водой, чистая фильтровальная бумага, урна для пипеток.
Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов
– биологический, люминесцентный, электронный и специальные методы микроскопии – фазово-контрастный, темнопольный.
В отечественных биологических (световых) микроскопах имеются сухие и иммерсионные объективы. При изучении микроорганизмов обычно применяют иммерсионный объектив, имеющий увеличивающую способность в 90 раз и короткое фокусное расстояние – 1,5-2,0 мм. Иммерсионный объектив погружают в кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла. При использовании окуляра с увеличением в 7 или 10 получаем общее увеличение в 630 или

Астраханский ГМУ
900 раз соответственно. Разрешающая способность иммерсионного объектива около 0,2 мкм.
Морфологию бактерий изучают методом микроскопии микропрепарата.
Техника приготовление микропрепаратов
4 этапа:
1. Приготовление мазка
2. Высушивание мазка
3. Фиксация
4. Окраска простым или сложным методом.
1.
На чистое и обезжиренное предметное стекло стерильной бактериальной петлёй наносится капля физ.раствора. Петля прокаливается.
Отуженной бактериальной петлёй забирается небольшое количество культуры бактерий с поверхности агара, эмульгируется в капле физ.раствора и круговым движениями распределяется по поверхности стекла, чтобы образовался мазок диаметром 1-1,5 см. Петля прокаливается и ставится в штатив.
2.
Мазок высушивается на воздухе. Если же высушивание препарата замедленно, то препарат подогревают, держа стекло мазком вверх, в струе тёплого воздуха высоко над пламенем горелки.
3.
Мазок фиксируется путём трёхкратного проведения стекла через пламя спиртовки.
Цель фиксации:
- убить бактерии;
- обеспечить плотное прикрепление микробов к стеклу;
- обеспечить лучшее прокрашивание.
4. Зафиксированный мазок окрашивается простым или сложным методом.
Наиболее пригодны анилиновые красители. Количество красителя должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка: достаточно несколько капель краски, наливаемых при помощи пипетки. По истечении срока окрашивания краску сливают с препарата и промывают. При этом со стекла смывается только лишняя краска; краска, адсорбированная микробами, остаётся. Оставшуюся на стекле краску осторожно удаляют,

Астраханский ГМУ слегка прижимая кусочек фильтровальной бумаги к стеклу. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим.
Способы окраски микробов делятся на простые и сложные, или дифференциальные. Простая окраска позволяет быстро и хорошо ознакомиться с общей морфологией микробов, ввиду чего этот способ применяется в лабораториях наиболее часто.
При простой окраске обычно употребляется одна краска, чаще – фуксин или метиленовая синяя.
Сложные способы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Они применяются для детального изучения структуры клетки, а также для характеристики и дифференциации данного микроба от других.