Файл: Fermentter-Now.doc

— ядро қабығының ферменттері: цитохромоксидаза, глутаматдегидрогеназа, НАД·Н-цитохром-с-редуктаза, арилсульфатаза А және Б, АТФ-аза (Mg²⁺), ацетилэстераза, метилбутириназа. Барлығы 8 фермент.

— митохондрия ферменттері: АТФ-аза (Mg²⁺, Na⁺, K⁺, Ca²⁺), сукцинатдегидрогеназа, цитохромоксидаза, β-оксибутиратдегидрогеназа, α-глицерофосфатдегидрогеназа, ацил-КоА-β-дегидрогеназа, НАД·Н-дегидрогеназа, май қышқылын тотықтырушы ферменттер, май қыш­қылдарын синтездеуші ферменттер, Кребс циклінің 5 ферменті, миокиназа, моноаминоксидаза, α-кетоглутаратдегидрогеназа, сукцинатцитохром–С-редуктаза, аспартатаминотрансфераза, орнитинкарбомоилтрансфераза, НАД·Н-цитохром-В₅-редуктаза, НАД·Н-оксидаза, пируватдегидрогеназа, пролиноксидаза, липоамиддегидрогеназа, кинуренингироксилаза, аденилаткиназа, нуклеозиддифосфокиназа. Барлығы 28 фермент.

— лизосома ферменттері: барлығы 35 фермент — катепсиндер, коллагеназалар, β-галактозидазалар, β-глюкоуронидазалар, гиалурони­даза, лизоцим, нейраминидазалар, ДНК-аза және РНК-аза, қышқылдық фосфатаза, фосфолипазалар, қышқылдық пирофосфотаза және қыш­қылдық АТФ-аза.

— пероксисома ферменттері: каталаза, пероксидаза, уратоксидаза, D-, L- аминоқышқылдарының оксидазалары.

— эндоплазмалық ретикулум ферменттері: НАД·Н-цитохром-с-ре­дуктаза, глюкозо-6-фосфатаза, нуклеотидтерінің дифосфатазасы, сілті­лік фосфатаза, 5'-нуклеотидаза. Барлығы 20 фермент.

— гиалоплазма ферменттері: гликолиз ферменттері, аденозиндезаминаза, гексозодифосфатаза, лактатдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, глутатионредуктаза, аспартатаминотрансфераза, аланинамино­трансфераза, глюкокиназа, глюконфосфорилаза, альдолаза, аконитаза. Барлығы 18 фермент.

Ферменттерді бөліп алу. Ұлпаларда ферменттер өте аз мөлшерде кездеседі. Ферменттерді бөліп алу үшін әртүрлі әдістерді қолданады. Көптеген ферменттерді адам мен жануарлардың асқорыту сөлдерінен алады (ол ферменттердің концентратты сулы ерттіндісі). Ұлпаларды суықта ыдырату (ұсақтау, кварц, құмдарымен үйкелеу, гомогендеу) арқылы экстракциялап (спирт, тұзды ерітінді және т.б.) ферменттерді бөледі. Адсорбция (Данилевский) тәсілі, ионалмасу хроматографиясы, центрифугалау, электрофорез әдістерін кең қолданады.

Фермент активтілігін анықтау. Бөліп алынған ферменттердің тазалығы оның активтілігі арқылы бағаланады. Егер фермент активтілігі ары қарай тазартқанда өзгермейтін болса, оны гомогенді таза фермент ретінде қабылдайды. Ферменттерді биологиялық материалдардан бөліп алу қиындық туғызады. Сондықтан ферменттің сандық мөлшерін оның субстратқа әсер еткендегі активтілігі арқылы жанама түрде анықтайды.

Химиялық реакцияның жылдамдығы фермент активтілігіне тығыз байланысты немесе тәуелді болады. Сол себептен ферменттің сандық мөлшерін екі түрлі жолмен келесі тендеулер арқылы анықтауға болады:

1. Фермент әсер ететін субстраттың, белгілі бір сандық мөлшерінің белгілі бір уақытта азаюы арқылы;

K = ΔS / Δt,

K — реакция жылдымдығының тұрақтысы, ΔS — субстрат мөлшері, Δt — уақыт өлшемі.

2. Реакция өнімінің мөлшерінің белгілі бір уақыт өлшемінде көбеюі арқылы

K = ΔP / Δt,

ΔP — реакция өнімі.

Бұл екеуі де абсолютті теңдей шамалар. Себебі неше субстрат ре­акцияға түссе сонша реакция өнімі түзіледі (массалардың сақталу заңы бойынша). Сондықтан кезкелгенін пайдалануға болады.

Фермент активтілігіне бірнеше факторлар әсер етеді. Оларды жалпы түрде үш топқа бөледі:

1. Торшадағы фермент мөлшерлері немесе оның биосинтезінің дең­гейіне тәуелділік;

2. Ферментативті реакциялардың жылдамдығына әсер етуші фак­торларға қатысты тәуелділік — субстраттың бар болуы, апофермент конформациясына әсер етуші активатор, ингибитор, кофакторлардың, денатурлаушы әсерлердің, температура, гидратация, рН, электролит­тердің болғандығы;

3. Ферменттердің шоғырлануы, мембрана өткізгіштігі, субстраттың фермент әсеріне ыңғайлылығы, реакция өнімдерінің әкетілу жылдам­дығына байланысты тәуелділік.

Фермент активтілігінің өлшем бірлігі. Халықаралық био­хи­мия­лық одақтың ферменттер бойынша комиссиясы 1962 ж. ферменттер мөлшерінің мәндерінің шамаларын көрсететін жалпы ережені ұсынды. Бұл ереже бойынша ферменттердің өзіндік активтілігі (Е) ретінде оның (Т = 25° С) 1 минутта субстраттың 1 микромолін катализдеуге (немесе 1 микромоль реакция өніміне айналуы) кеткен мәні алынады.

1 ХБ = 1 мкмоль/мин

ХБ — халықаралық бірлік (орыс тілінде МЕ-международная единица).

Сонымен бірге СИ жүйесінде фермент активтілігін — катал бірлігі бойынша өлшеу қабылданған. Катал бұл 1 моль субстратты (немесе 1 моль реакция өнімі түзілуін) 1 секундта катализдеуге кеткен фермент активтілігінің мәні

1 катал = 1 моль/с

Клиникалық биохимиялық зерттеулерде фермент активтілігіне әсер ететін биологиялық сұйықтықтың көлеміне (V) қатысты каталдың литрге қатынасы (катал/литр) алынады.

Фермент активтілігін анықтаудың қазіргі заманғы әдістеріне спектрофотометрлік, флюориметрлік, полярографикалық, колориметрлік және т. б. тәсілдер жатқызылады.

Ферменттердің әсер ету механизмдері.

Ферменттік катализдің теориялық негіздері.

Ферменттер басқа да катализаторлар (бейорганикалық) тәрізді тер­модинамикалық тұрғыдан жүруі мүмкін емес реакцияны жүргізбейді. Тек, жүре алатын реакцияның жылдамдығын ғана жоғарлатады. Кез келген химиялық реакцияның жүру мүмкіндігі оның реакция өнімдер­інің энергиясының реакцияласушы заттардың энергиясынан төмен немесе бірдей болғанында ғана өтеді. Реакция қашанда бос энергияның төмендеуі бағытына қарай жүреді, сондықтан реакция тепе-теңдігі өнімдер түзілуіне сәйкес ығысады. Бірақ, кез келген реакция басталуы үшін оның кедергі энергиясын, активтеуші энергияны қосу арқылы жеңуі қажет. Себебі реакция жүргенде кедергі энергиясының энергия­лық қоры артық аздаған молекулалар ғана әсерлеседі. Бұл жағдайда реакция жылдамдығы да баяу болады.

Р

Екі заттың реакциясын байқағанда

АВ + CD ↔ AD + BC

реакция өнімдері (AD, BC) түзілуі үшін АВ және CD әсерлесуіне қажет а-ға тең (активтендіруші энергия) энергияны қосымша алуы қажет. Ал реакция кері бағытта жүре­тін болуы үшін б-ға тең шамадағы көп мөлшерде энергия қажет. Сол себепті кері бағытта жүретін реакцияның активтендіру­ші энергиясы (Е_а) жоғары болады. Бұл жағ­дайда екі реакция үшін де бірдей өзгеретін бос энергияның шамасын в-кесіндісі көрсетеді. Солдан оңға қарай өтетін реакция экзотермиялық, ал кері бағыттағы реакция эндотермиялық болады. Сондықтан реакцияларды эндергоникалық (энергияны қабылдап жүретін реакция) және экзергоникалық (энергия бөліп жүретін реакция) реакцияларға бөледі. Реакция жүргенде энергияның жылу түрінде бөлінуі немесе қосып алуы міндетті емес.

Реакция жылдамдығының жоғарлауы катализатордың Е_а-ны (кедері энергиясын) төмендетуі арқылы өтеді. Ол суретте үзікті сызықпен көрсетілген. Мысалы, сутегі асқын тотығын (Н₂О₂) сутегі мен оттегіге бөлу үшін (Н₂О₂ → Н₂↑ + О₂↑) Е_а = 75,2 кДж/моль қажет. Коллоидтық пласты катализатор ретінде қолданғанда Е_а = 50,2 кДж/моль, ал биокатализатор каталаза қатысқанда Е_а = 8,3 кДж/моль қажет болады.

Биокатализатор-ферменттің жылдамдығын жоғарлатуы немесе Е_а-ны төмендеуі көп этапты механизм арқылы іске асады.

Сур. 6. Фермент пен субстраттың әсерлесу механизмі (Михаэлис-Ментен).

Ферментативті реакцияның жүруін жалпы түрде үш этапқа бөледі.

немесе фермент + субстрат ↔ фермент-субстраттық комплекс →
→ өнім + фермент.

Бұл реакция теңдеуінде (Михаэлис-Ментен теңдеуі) шешуші рольді фермент пен субстраттың қосылуынан түзілген фермент-суб­страттық комплекс атқарады. Ферменттің әсерлесу спецификасына тәуелді өтетін бұл қосылыс белгілі бір байланыстардың әлсізденіп бір мезгілде субстрат активтелінуі мен реакцияласушы қабілетінің жоғар­лауына әкеледі. Фермент-субстраттық комплексте бір мезгілде екі процесс өтеді: алғашқыда, комплекстің электрондар тығыздығының өзгеруі нәтижесінде ондағы байланыстардың полярлануы және соңынан субстрат молекуласындағы және активтік орталықтағы кейбір байланыс­тардың геометриялық деформациясы. Мо­ле­ку­ла­лар­да­ғы химиялық байланыстардың деформациясы мен полярлануы фермент-субстрат комлексінің аралық қалпындағы кедергіні (активтеуші энергияны (Е_а)) жеңуді қамтамассыз етеді. Ферментативтік катализдің бірінші этапында фермент пен субстраттың бір бірмен ковалентті немесе басқа түрлі байланысуы өтеді. Екінші этапта субстрат оған байланысқан ферменттің әсерінен химиялық өзгерістерге түседі. Соның нәтижесінде фермент-өнім комплексі пайда болады. Үшінші этапта фермент-өнім комплексі бөлініп фермент және өнімге ажыратылады. (Осы тараудағы активтік, жанастырушы, аллостерлік оралықтар тақырыбын қараңыз).

Қысқа уақытта «өмір сүріп», жылдам арада құрам бөліктеріне ажырайтын фермент-субстрат комплексі туралы түсінік 1913 ж. Михаэлис пен оның шәкірті Ментеннің ферментативті реакциялардың кинетикасына анализ жасауы нәтижесінде дамытылды және кейін Михаэлис-Ментен теориясы деп аталды. Бұл теория бойынша жоғарыда келтірілген схема ферментаттік процесстің үдеуі, энергетикалық тұрғыдан, реакцияның кедергі энергиясын тұрақсыз фермент-субстрат комплексі түзілуі көмегімен «айналып» өтуі арқылы іске асады. Комплекстің түзілуінде және ыдырауында аралық реакциялардың энергиясын негізгі реакцияға қараған­да төмендеу кедергілік энергияда болады.

Қайтымды реакция жүргенде ферментпен (Е) субстрат (S) (реакциялар жылдамдығы тұрақтысы k₁ және k₂) комплекс (ES) түзеді. Комплекс (ES) фермент пен өнімге реакция жылдамдығы тұрақтысы k_S бойынша ыдырайды. Комплекс (ES) диссоциациалануы мүмкін бол­ғандықтан оның диссоциация тұрақтысы (k_S = k₂ / k₁) теңдеуі бойынша есептеледі. Егер комплекстің диссоциация тұрақтысы жоғары болса қайтымды реакцияның k₂-сінің мәні де жоғары, ал k₁ мәні төмен болады. Сондықтан комплекс алғашқы қосылыстарға жеңіл бөлінеді де реакция баяу жүреді. Егер, керісінше k₁ мәні жоғары болса, k_S пен k₂ мәңдері төмен сол себепті кері бағыттағы реакцияның жүруі бәсеңдей­ді, диссоциация төмендейді, ал ферменттік реакция тікелей бағытта жылдам жүреді.

Массалардың әсерлесу заңы бойынша теңдеуді келесі түрде жазуға болады:

[S] · ([E₀] − [ES]) = k_S · [E·S]

[E₀] — реакция басталардағы ферменттің жалпы концентрациясы, [ES] — фермент-субстрат комплексі концентрациясы. [E₀] − [ES] — бастапқы фермент концентрациясынан фермент-субстрат комплексі концентрациясын алғандағы фермент концентрациясы.

Теңдеуді ары қарай ықшамдағанда, келесі түрге келеді:

.

Келтірілген теңдеуге сәйкес, егер [ES] концентрациясы неғұрлым көп болса ферменттік реакция жылдамдығы да жоғары болады. Ал, жылдамдық максимумы тек [ES] концентрациясы фермент концентрациясына теңескенде ғана немесе [ES] = [E₀] барлық фермент фермент-субстрат қосылысына түзілгенде жетеді. Реакция жылдамдығының максимумдық жылдамдыққа қатынасы келесі түрде беріледі:

Бұл теңдеуді жоғарыда келтірілген теңдеумен қосып ықшамдап келесі өрнекті алуға болады:

немесе

Т

Теңдеудің шешімі келесі жағдай­ды түсіндіре алады. Егер [S] мәні K_S-ке қарағанда үлкен болса (сахарозаны β-фруктофуранозидазамен гидролиздегенде K_S = 0,0167 М) реакция жыл­дамдығы жылдамдық максимуміне тең болады (v = v_max).

Михаэлис-Ментен реакция жыл­дам­дылығы мен субстрат концентрациясы арасындағы тәуелділікті β-фруктофуранозидаза әсерінен сахароза, глюкоза, фруктоза ыдырауларын (сур.7) график түрінде көрсетті. Суреттегі қисық сызық бойынша реакция алғашқыда нольдік ретте жүрсе, соңынан бірінші ретпен жүретіндігі байқалады.

Соның негізінде ферменттік реакцияның толық жалпы жылдам­дығын келесі теңдеу арқылы есептеуге болады.

v = K_m · [ES], K_m — Михаэлис тұрақтысы (K_m = K₃ / K₄).

Михаэлис тұрақтысының өлшем бірлігі моль/л тең. Егер реакция жыл­дамдығы жылдамдық максимумының жартысына тең болса (v = ½v_max) Михаэлис тұрақтысы субстрат концентрациясына тең болады (K_m = [S]). Михаэлис тұрақтысы (K_m) қашанда диссоциация тұрақтысынан (K_S) бірнеше есе жоғары болады (мысалы, алкогольдегидрогеназаның K_S = 10⁻⁷ моль/л, ал K_m = 10^-3 моль/л). Сондықтан, ферментативті реакциялардың жылдамдығы басқа реакцияларға қарағанда өте жоғары, себебі, көптеген заттар үшін K_S = 10^-2—10^-7 аралығында болады. Михаэлис-Ментен теңдеуін ары қарай Лайнуивер мен Берк, Холдейн-Бриггс дамытты.

Ферменттердің әсерлесуінің ерекшеліктері. Ферменттердің бей­органикалық катализаторлардан өзгешелігі олардың өте нәзік маман­дандырылған әсер ету ерекшелігіне қабілеттілігі. Олар қатаң түрде белгілі бір реакцияларды катализдейді. Тек осы қасиеті арқылы ғана жекеленген ферменттік реакциялардың бір бірмен тығыз байланысты болуы және қатаң түрде реттеліп жүруі сақталады. Бұл тірі торшалар мен ағзалардың өмір сүруі үшін қажетті, заттар алмасуларына қажетті әртүрлі биохимиялық реакциялардың бірігуі болып табылады.

Ф

Қазіргі кезде фермент пен суб­страттың әсерлесу ерекшелігінің механизміне екі гипотеза (Фишер және Кошленд) ұсынылған.

Фишердің гипотезасы бойынша, фермент өзі әсер ететін субстратқа кілттің құлыпқа сәйкес келуіндей жанасады. Әртүрлі гликозидтерді ферменттермен гидролиздеуді зерттеген жұмысында Э.Фишер «…хи­миялық әсерлесу атқарылуы үшін энзим мен глюкозид бірі біріне кілттің құрыпқа келгеніндей дәл келуі қажет» деп жазған.

Ол фермент геометриялық және химиялық тұрғыдан өте қатаң, тұрақты құрылымда болады деп қабылдаған. Бұл құрылымның сәл де болса өзгеруі кілттің өзгеруі тәрізді құлыпқа сәйкес келмей қалады.

Соңғы кездері қатаң немесе тұрақты мықты құрылымға қарама қарсы майысқақ, созылмалы құрылым туралы гипотеза (американдық ғалым Д.Кошленд) ұсынылды.