Файл: Офс 2 0001. 15 Биологические испытания инсулина.pdf

Методы биологического анализа
Выполнили ординаторы ФО-3312

ОФС.1.2.4.0001.15 Биологические испытания инсулина
Биологические методы испытания инсулина основаны на сопоставлении гипогликемического
(
сахаропонижающего) действия испытуемого препарата (ИП) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов
Биологические методы используют для определения следующих показателей качества:
Биологическая активность
Биоидентичность
Пролонгированное действие
Позволяет количественно определять содержание гипогликемического действующего вещества. Данное определение может проводиться для аттестации СО инсулина при отработке новых производственных технологий для оценки качества и в ходе проверки стабильности в процессе установления срока годности
Показатель используется для подтверждения подлинности лекарственных средств инсулина или его аналогов по наличию у них гипогликемического действия
Показатель качества лекарственных препаратов инсулина удлиненного действия и их аналогов, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта во времени. Данный показатель является обязательным для всех пролонгированных препаратов и аналогов инсулина
Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:
Испытания проводят на
• кроликах (метод А);
•мышей (метод В).
Определение биоидентичности представляет собой вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов, подтверждающий подлинность препарата с использованием минимального количества животных.
Испытания проводят на
• кроликах (метод А);
•мышей (метод В).
Испытания проводят на
• кроликах (метод А);
Абдурахманова Д.К.

ОФС.1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины
Настоящая статья описывает методы определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения и фармацевтических субстанциях, используемых для их изготовления.
Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив). ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами. В результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина.
Существуют три основных методологических подхода для проведения данного испытания: гель-тромб метод, основанный на образовании геля; турбидиметрический метод, основанный на помутнении реакционной смеси после расщепления субстрата, содержащегося в ЛАЛ-реактиве; и хромогенный метод, основанный на появлении окрашивания после расщепления синтетического пептид- хромогенного комплекса.
В данной статье описаны следующие шесть тестов, основанных на описанных выше принципах:
– Качественный гель-тромб тест (Метод А);
– Количественный гель-тромб тест (Метод В);
– Турбидиметрический кинетический тест (Метод С);
– Хромогенный кинетический тест (Метод D);
– Хромогенный тест по конечной точке (Метод Е);
– Турбидиметрический тест по конечной точке (Метод F).
Испытание проводят любым из шести приведенных методов. В случае сомнений или разногласий окончательное заключение принимают на основании результатов, полученных при проведении испытания методом А.
Байнова Ю.А.

ОФС.1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины
Гель-тромб тест (Методы А и В)
Гель-тромб метод позволяет установить наличие или измерить количественно концентрацию эндотоксинов в пробе. В результате реакции ЛАЛ-реактива с эндотоксином увеличивается вязкость реакционной смеси вплоть до формирования плотного геля.
Для обеспечения точности и достоверности испытаний заявленную чувствительность ЛАЛ-реактива следует подтвердить, а также провести испытание на наличие мешающих факторов, как описано в разделе «Предварительные анализы».
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод А)
Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод В)
Этим методом определяют содержание бактериальных эндотоксинов с помощью ряда последовательных разведений испытуемого лекарственного средства.
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (Методы C, D, E и F) ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (C и F)
Турбидиметрические методы относятся к фотометрическим методам, основанным на измерении степени мутности реакционной смеси. В зависимости от принципа, положенного в основу проведения испытания, указанный метод может быть проведен как турбидиметрический тест по конечной точке, либо как турбидиметрический кинетический анализ.
Турбидиметрический тест по конечной точке (Метод F) основан на измерении степени мутности реакционной смеси в конце инкубационного периода, которая зависит от концентрации эндотоксина.
Турбидиметрический кинетический тест (Метод С) основан на определении скорости развития мутности реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности.
Испытание проводят при температуре инкубирования, рекомендованной производителем ЛАЛ-реактива
(обычно 37 ± 1°С).
Байнова Ю.А.

ОФС.1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины
ХРОМОГЕННЫЕ МЕТОДЫ (D и E)
Хромогенные методы используют для измерения количества хромофора, высвободившегося из хромогенного субстрата в результате реакции эндотоксинов с
ЛАЛ-реактивом. В зависимости от принципа, положенного в основу испытания, этот метод может быть проведен как хромогенный тест по конечной точке или как хромогенный кинетический анализ.
Хромогенный тест по конечной точке (Метод Е) основан на измерении интенсивности окраски реакционной смеси, зависящей от количества хромофора, высвободившегося в конце инкубационного периода. Количество, выделившегося хромофора, зависит от концентрации эндотоксина.
В процессе испытания хромогенным кинетическим методом (метод D) определяют скорость развития окраски реакционной смеси, измеряемой по времени, необходимому для достижения заданной величины оптической плотности реакционной смеси.
Испытание проводят при температуре инкубирования, рекомендованной производителем
ЛАЛ-реактива (обычно 37 ± 1°С).
Интерпретация результатов
Лекарственное средство считают выдержавшим испытание, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов в повторностях раствора А (с учетом разведения и концентрации испытуемого лекарственного средства) менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.
Байнова Ю.А.

Пирогенность.ОФС 1.2.4.0005.15
Испытание пирогенности инъекционных растворов и фармацевтических субстанций из которых они изготавливаются основано на измерение температуры тела у кроликов до и после инъекций.
Содержание животных и подготовка их к проведению испытания
Отдельная клетка на полноценном пищевом рационе, ограждают от раздражающих воздействий (акустических, оптических и др). В помещении поддерживают постоянную температуру воздуха 20 +-3С. Осмотр животных, отбирают здоровых кроликов одного пола, не альбиносов, с массой тела от 2,0 до 3,5 кг.
За 18 часов до испытания кроликов лишают корма без ограничения воды. Во время опыта животные не получают ни корма ни воды. Производят осмотр, взвешивание, измерение t – тела
Материалы и оборудование
Должны быть стерильными и апирогенными: посуда, шприцы, иглы для инъекций, (t нагревания 250С – 30 мин. Или 200С
– 60 мин). Для разведения испытуемых ЛС используют натрия хлорид раствор 0,9%.
Ректально измеряют t с точностью до 0,1С ртутным или электронным термометром с термочувствительным датчиком,
вводят в прямую кишку кролика на глубину от 5 до 7,5 см в зависимости от масс тела животного.
Введение испытуемого ЛС
ЛС вводят в ушную вену кролика, объем инъецируемого раствора 0,2 мл не более 10 мл на 1,0 кг массы тела животного.
Раствор подогревают до t 37,0 +- 2С.
Проведение испытания
Три кролика, исходная температура 38,5 – 39,5С. Дважды измеряют t, интервал 30 мин различие t не должно превышать
0,2С. Исходная температура - последний результат измерения, после вводят ЛС с интервалом не более 30 мин на протяжении 3-х часов. Учет результатов
Испытание проводят поэтапно, не превышая четырех. По окончании каждого из этапов испытания определяют максимальное измерение t (ϫt) тела каждого кролика по сравнению с исходным значением.
Для 3-х кроликов определяют сумму индивидуальных максимальных повышений t (∑ ϫt). Значение ∑ ϫt, полученные на разных этапах испытания, последовательно суммируют, а результаты сравнивают с уровнями, указанными в таблице 1.
После первого этапа испытания ЛС признают апирогенным, полученный результат меньше или равен 1,2С (Таблица 1, колонка 3), а индивидуальное повышение t ни у одного из кроликов не превышает 0,5С (колонка 4).
Если результат на первом этапе превышает 1,2С (колонка 5), а индивидуальное повышение t более чем на 0,5С (колонка 6) хотя бы у одного из трех кроликов то проводят 2-ой этап испытания
Богатырева Е.В.

Пирогенность.ОФС 1.2.4.0005.15
На 2-ом этапе ЛС признают апирогенным при получении результата меньше или равен 2,8С (колонка3), а индивидуальное повышение t свыше 0,5С (колонка 4) отмечено не более, чем у одного из шести кроликов.
Если результат на втором испытании больше 2,8С (колонка 5) но меньше 4,3С, или более, а индивидуальное повышение t свыше 0,5С (колонка 6), проводится 3-й этап испытания.
На третьем этапе ЛС признают апирогенным при получении результата меньше или равен 4,5С (колонка 3), а индивидуальное повышение t свыше 0,5С (колонка 4) отмечено не более, чем у двух из девяти кроликов.
Результат на 3-ем испытании получен больше 4,5С, но меньше 6,0С (колонка 5), а индивидуальное повышение t свыше
0,5С (колонка 6) отмечено не более, чем у двух животных, необходимо перейти к четвертому этапу испытания.
На 4-ом этапе ЛС признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 6,6С (колонка 3), а индивидуальное повышение t свыше 0,5С (колонка 4) отмечено не более, чем у трех двенадцати кроликов.
Лекарственный препарат признают пирогенным, если результат на втором или последующих этапах испытания выше, чем величины. ЛС признают пирогенным в том случае, если в результате 4-х этапов испытания зарегистрировано индивидуальное повышение t свыше 0,5С более, чем у трех кроликов из двенадцати.
Богатырева Е.В.

Тест активации моноцитов
• Тест активации моноцитов (МАТ) – это новый метод определения полного спектра пирогенных веществ, включая бактериальные эндотоксины и пирогены неэндотоксиновой природы
(пептидокгликаны, дрожжи, грибы, вирусы).
Тест является полной заменой анализа на пирогенность, проводимого на кроликах, и позволяет отказаться от использования животных. Данный метод особенно актуален для проверки иммуно-биологических препаратов – вакцин, сывороток, альбуминов, проверка которых в ЛАЛ-тесте не всегда возможна из- за сильного влияния компонентов препарата на реакцию эндотоксинов с ЛАЛ-реактивом.
Ермакова Н.В.

I.
Раствор испытуемого препарата с моноцитами инкубируют в СО2-инкубаторе при температуре
37 °С в течение 18-22 часов, подготовку клеток и растворов испытуемых препаратов и контролей необходимо проводить в ламинаре, соблюдая все правила работы с клетками.
II. Определяют содержание выделившегося интерлейкина-6 с помощью метода ИФА.
Калибровочную кривую строят с помощью растворов стандарта эндотоксина. Оптическую плотность растворов измеряют при длине волны
450 нм на стандартном спектрофотометре.
Анализ проводится в два этапа
Ермакова Н.В.

Вирусная безопасность ОФС. 1.2.4.0015.18
 Требования, предъявляемые к обеспечению вирусной безопасности для ЛС, полученных с использованием материалов человеческого или животного происхождения, устанавливаются уполномоченным органом в соответствии с требованиями действующих нормативно-правовых актов РФ.
 Для обеспечения вирусной безопасности ЛС при производстве, должны проводиться следующие мероприятия:
1. отбор и испытание исходного сырья, и источника материалов на отсутствие вирусов, патогенных для человека;
2. оценка возможностей инактивации и/или элиминации вирусного агента в ходе производственного процесса;
3. проведение испытаний на отсутствие вирусной контаминации на критических стадиях производства.
 Для минимизации риска вирусной контаминации при отборе исходного сырья и материалов необходимо
соблюдать следующие условия:
1. Сырье человеческого происхождения (кровь, моча, или другие биологические жидкости человека-обязательное обследование в соответствии с НД, действующими на территории РФ) заготавливают от здоровых доноров.
2. Сырье животного происхождения следует отбирать только от животных из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям(соответствии с НД, действующими на территории РФ-обязательной ветеринарно-санитарной экспертизе)
3. Следует определять род и источник происхождения животных, предназначенных для производства биотехнологических лекарственных препаратов, включая генотип и возраст.
4. Материалы и реагенты биологического происхождения (такие, как бараньи эритроциты, сыворотка эмбрионов телят,
бычий сывороточный альбумин, человеческий трансферрин, инсулин, трипсин и др.).
 При вирусной элиминации и/или инактивации вирусов в составе ЛС исходное сырье и материалы подвергаются
обработке следующими методами (должны быть валидированы):
- физическими стерилизация, обработка паром, сухой нагрев, радиация, фильтрация); (стерилизация насыщенным водяным паром под давлением, горячим воздухом, фильтрованием, ионизирующим излучением);
- химическими (разрушение суперкапсида оболочечных вирусов, содержащего липиды, с помощью детергентов);
- комбинированными (нейтрализация специфическими антителами, удаление вирусов хроматографическими методами,
нагревание в форме суспензии с химическими агентами и другими).
 Испытания на отсутствие контаминации инфекционными вирусами на этапах производства
Испытания должны проводиться методами, охарактеризованными по специфичности и аналитической чувствительности.
В ЛС, полученных из крови, плазмы крови, мочи, органов и тканей человека, с помощью валидированных методов должно быть подтверждено отсутствие маркеров вирусов гепатита В и С, ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Матякубова Е.Б.