ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.11.2023
Просмотров: 85
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Занятие № 4Тема: «Лабораторная диагностика дифтерии».
Культивирование. Коринебактерии дифтерии плохо растут на обычных средах; для культивирования нужны среды, обогащены кровью, сывороткой или яйцами. Оптимальной температурой для роста является 37ºC (от 15 до 40ºC), оптимальной рН - 7,2. Бактерии являются аэробами и факультативными анаэробами. Средами, которые используют для культивирования дифтерийных бактерий, являются скошенный сывороточный агар Леффлера и теллуритовый кровяной агар. Бактерии очень быстро растут на агаре Леф-флера с образованием первых колоний через 6-8 часов, задолго до того, как вырастают другие бактерии. На первых порах колонии имеют вид небольших круглых белых непрозрачных дисков, но при продолжении инкубации увеличиваются в размерах и приобретают характерный жёлтый оттенок. Теллурит (0,4 %) угнетает рост большинства других бактерий, выступая в качестве селективного агента. Дифтерийные бактерии редуцируют теллурит до металлического теллурия, который входит в состав колоний и окрашивает их в серый или чёрный цвет. Классификация. На основе изучения морфологии колоний, которые выросли на теллуритовой среде и других свойств, Маклеод выделил 3 типа дифтерийных бактерий: gravis, intermedius и mitis, недавно был добавлен четвертый тип - belfanti. Названия были предложены для обозначения степени тяжести болезни, которую эти типы вызывали: gravis вызывал наиболее тяжёлое заболевание, mitis – наименее тяжёлое, а intermedius находился посредине, однако в настоящее время эта связь непостоянна. Однако определенные биологические признаки этих типов имеют относительную ценность: типы gravis и intermedius в большинстве случаев вызывают развитие параличей и летальный исход, а инфекции mitis вызывают обструкционные поражения дыхательных путей. Штаммы mitis превалируют в эндемических районах, а типы gravis и intermedius являются эпидемическими. Тип mitis может выступать как комменсал в макроорганизме. В популяциях людей с природным или искусственно созданным иммунитетом типы gravis и, в меньшей степени, intermedius распространяются более быстро, чем mitis.Лабораторная диагностика. Лабораторное подтверждение дифтерии необходимо для эпидемиоло-гического контроля и разработки профилактических мероприятий, а не для лечения больных. Специфическое лечение следует назначать немедленно при подозрении на дифтерию, не дожидаясь результатов лабораторных тестов, любая задержка может стать роковой.
Целью лабораторной диагностики является изоляция дифтерийных бактерий и демонстрация их токсичности. Берут 1-2 образца с пораженных участков с помощью шпателя. Бактерии не всегда выявляют в мазках с пораженного участка, а также их не всегда можно отличить от комменсалов, которые составляют нормальную микрофлору глотки. Таким образом, только бактериоскопического исследования недостаточно для постановки диагноза “дифтерия”, но оно является важным в диагностике ангины Винсента. Для этого мазок красят по Граму или Лейшману и изучают спирохеты Винсента и фузиформные бактерии. Токсигенные коринебактерии дифтерии можно выявить в мазках методом иммунофлюоресценции. Для культивирования материал переносят на свернутую сыворотку Леффлера, теллуритовый кровяной агар и чашку с обычным кровяным агаром (для дифференцирования от стафилококкового или стрептококкового фарингита, которые могут симулировать дифтерию). Если материал невозможно сразу перенести в питательную среду, его нужно сохранять смоченным стерильной сывороткой для сохранения жизнеспособности бактерий. На свернутой сыворотке рост можно наблюдать уже через 4-8 часов, но при его отсутствии следует инкубировать культуру еще 24 часа. В мазках, окрашенных метиленовым синим или одним из специальных методов (по Нейссеру или Альберту) выявляют бактерии с метахроматическими гранулами и типичным расположением. Культуры на теллуритовом агаре следует инкубировать минимум 2 дня, поскольку в некоторых случаях рост может быть замедленным. Теллуритовая среда играет значительную роль в изоляции коринебактерий дифтерии от носителей, лиц, которые переболели дифтерией или контактировали с больными, поскольку у этого контингента рост коринебактерий может быть угнетен другими бактериями. Тесты на определение вирулентности. Каждый изолят коринебактерий дифтерии следует исследовать на вирулентность и токсигенность для полной бактериологической диагностики. Тесты на определение вирулентности можно проводить методами in vivo (подкожное и внутрикожное введение животным) и in vitro (реакция преципитации и тест в культурах тканей). Подкожное введение. Культуру коринебактерий, которая выросла после 12-часовой инкубации на свернутой сыворотке Леффлера, растворяют в 2-4 мл бульона и вводят подкожно 0,8 мл эмульсии двум мор-ским свинкам, одной из которых за 18-24 часа до этого ввели 500 единиц дифтерийного антитоксина. Если штамм является вирулентным, то неиммунизированное животное гибнет через 4 часа; при его вскрытии вы-являют все симптомы, перечисленные в подразделе “Патогенность для животных” этого параграфа. Этот тест уже не используют в связи с изменениями правил работы с лабораторными животными.
Внутрикожное введение. Бульонную эмульсию культуры вводят внутрикожно двум морским свинкам (или кроликам) по 0,1 мл в два различных места каждой. Одно животное служит контролем, ему за день до эксперимента вводят 500 единиц антитоксина. Другому животному вводят внутрибрюшинно 50 единиц антитоксина через 4 часа после внутрикожного введения. Токсигенность оценивают по воспалительной реакции, которая прогрессирует до некроза через 48-72 часа у опытного животного, у контрольного животного изменений не происходит. Преимуществом этого теста является то, что животные не умирают. На одном кролике можно протестировать 10 штаммов. Реакция преципитации Элека. Прямоугольную полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифте-рийным антитоксином (1000 единиц в 1 мл) помещают на поверхность чашки Петри с агаром, который со-держит 20 % сыворотки крови лошадей; когда агар ещё жидкий. Вместо лошадиной сыворотки можно ис-пользовать сыворотку овец или кроликов. После эту поверхность подсушивают и делают узкие посевы штаммов под прямыми углами к полоскам фильтровальной бумаги. Чашку инкубируют при 37ºС в течение 24-48 часов. Токсины, которые продуцируются бактериями во время их роста, растворяются в агаре и при контакте с антитоксином в оптимальной концентрации проявляется линия преципитации. Наличие таких линий преципитации (в виде головок стрелок) является доказательством токсигенности штамма, отсутствие - наоборот. Этот тест очень удобен и экономен, но следует помнить, что некоторые пептоны и сыворотки непригодны для использования. Тест в культурах тканей. Токсигенность дифтерийных коринебактерий можно продемонстрировать путём нанесения штаммов в агаре на монослой клеточных культур. Токсин, который продуцируют бактерии, диффундирует в клетки и разрушает их. Описано около 15 типов бактериофагов. Типы I и III - это mitis, IV и VI - intermedius, VИИ - невиру-лентный gravis, а другие - вирулентные gravis. Фаготипы являются относительно стабильными. В лабораторной диагностике используют бактериоцины (дифтерицины), молекулярно-генетический метод. 5.2. Материал для самоподготовкиВопросы для самоподготовки врачей-курсантов:
7. Методика постановки РНГА для расчета наличия антитоксического иммунитета.8. Специфическая и неспецифическая профилактика дифтерии.9. Лечение. Схема применения антитоксической противодифтерийной сыворотки.Тесты для самоподготовки:
-
Актуальность темы: Дифтерия — это острое инфекционное заболевание, характеризующееся воспалительным процессом с образованием фибринозной пленки на месте внедрения возбудителя и явлениями общей интоксикации. Инфекция остается контагиозной и опасной инфекцией в связи с тяжелым течением и летальностью. Отличается управляемостью при четкой организации иммунопрофилактики и создания коллективной иммунной прослойки (96%). -
Учебные цели занятия:
Культивирование. Коринебактерии дифтерии плохо растут на обычных средах; для культивирования нужны среды, обогащены кровью, сывороткой или яйцами. Оптимальной температурой для роста является 37ºC (от 15 до 40ºC), оптимальной рН - 7,2. Бактерии являются аэробами и факультативными анаэробами. Средами, которые используют для культивирования дифтерийных бактерий, являются скошенный сывороточный агар Леффлера и теллуритовый кровяной агар. Бактерии очень быстро растут на агаре Леф-флера с образованием первых колоний через 6-8 часов, задолго до того, как вырастают другие бактерии. На первых порах колонии имеют вид небольших круглых белых непрозрачных дисков, но при продолжении инкубации увеличиваются в размерах и приобретают характерный жёлтый оттенок. Теллурит (0,4 %) угнетает рост большинства других бактерий, выступая в качестве селективного агента. Дифтерийные бактерии редуцируют теллурит до металлического теллурия, который входит в состав колоний и окрашивает их в серый или чёрный цвет. Классификация. На основе изучения морфологии колоний, которые выросли на теллуритовой среде и других свойств, Маклеод выделил 3 типа дифтерийных бактерий: gravis, intermedius и mitis, недавно был добавлен четвертый тип - belfanti. Названия были предложены для обозначения степени тяжести болезни, которую эти типы вызывали: gravis вызывал наиболее тяжёлое заболевание, mitis – наименее тяжёлое, а intermedius находился посредине, однако в настоящее время эта связь непостоянна. Однако определенные биологические признаки этих типов имеют относительную ценность: типы gravis и intermedius в большинстве случаев вызывают развитие параличей и летальный исход, а инфекции mitis вызывают обструкционные поражения дыхательных путей. Штаммы mitis превалируют в эндемических районах, а типы gravis и intermedius являются эпидемическими. Тип mitis может выступать как комменсал в макроорганизме. В популяциях людей с природным или искусственно созданным иммунитетом типы gravis и, в меньшей степени, intermedius распространяются более быстро, чем mitis.Лабораторная диагностика. Лабораторное подтверждение дифтерии необходимо для эпидемиоло-гического контроля и разработки профилактических мероприятий, а не для лечения больных. Специфическое лечение следует назначать немедленно при подозрении на дифтерию, не дожидаясь результатов лабораторных тестов, любая задержка может стать роковой.
Целью лабораторной диагностики является изоляция дифтерийных бактерий и демонстрация их токсичности. Берут 1-2 образца с пораженных участков с помощью шпателя. Бактерии не всегда выявляют в мазках с пораженного участка, а также их не всегда можно отличить от комменсалов, которые составляют нормальную микрофлору глотки. Таким образом, только бактериоскопического исследования недостаточно для постановки диагноза “дифтерия”, но оно является важным в диагностике ангины Винсента. Для этого мазок красят по Граму или Лейшману и изучают спирохеты Винсента и фузиформные бактерии. Токсигенные коринебактерии дифтерии можно выявить в мазках методом иммунофлюоресценции. Для культивирования материал переносят на свернутую сыворотку Леффлера, теллуритовый кровяной агар и чашку с обычным кровяным агаром (для дифференцирования от стафилококкового или стрептококкового фарингита, которые могут симулировать дифтерию). Если материал невозможно сразу перенести в питательную среду, его нужно сохранять смоченным стерильной сывороткой для сохранения жизнеспособности бактерий. На свернутой сыворотке рост можно наблюдать уже через 4-8 часов, но при его отсутствии следует инкубировать культуру еще 24 часа. В мазках, окрашенных метиленовым синим или одним из специальных методов (по Нейссеру или Альберту) выявляют бактерии с метахроматическими гранулами и типичным расположением. Культуры на теллуритовом агаре следует инкубировать минимум 2 дня, поскольку в некоторых случаях рост может быть замедленным. Теллуритовая среда играет значительную роль в изоляции коринебактерий дифтерии от носителей, лиц, которые переболели дифтерией или контактировали с больными, поскольку у этого контингента рост коринебактерий может быть угнетен другими бактериями. Тесты на определение вирулентности. Каждый изолят коринебактерий дифтерии следует исследовать на вирулентность и токсигенность для полной бактериологической диагностики. Тесты на определение вирулентности можно проводить методами in vivo (подкожное и внутрикожное введение животным) и in vitro (реакция преципитации и тест в культурах тканей). Подкожное введение. Культуру коринебактерий, которая выросла после 12-часовой инкубации на свернутой сыворотке Леффлера, растворяют в 2-4 мл бульона и вводят подкожно 0,8 мл эмульсии двум мор-ским свинкам, одной из которых за 18-24 часа до этого ввели 500 единиц дифтерийного антитоксина. Если штамм является вирулентным, то неиммунизированное животное гибнет через 4 часа; при его вскрытии вы-являют все симптомы, перечисленные в подразделе “Патогенность для животных” этого параграфа. Этот тест уже не используют в связи с изменениями правил работы с лабораторными животными.
Внутрикожное введение. Бульонную эмульсию культуры вводят внутрикожно двум морским свинкам (или кроликам) по 0,1 мл в два различных места каждой. Одно животное служит контролем, ему за день до эксперимента вводят 500 единиц антитоксина. Другому животному вводят внутрибрюшинно 50 единиц антитоксина через 4 часа после внутрикожного введения. Токсигенность оценивают по воспалительной реакции, которая прогрессирует до некроза через 48-72 часа у опытного животного, у контрольного животного изменений не происходит. Преимуществом этого теста является то, что животные не умирают. На одном кролике можно протестировать 10 штаммов. Реакция преципитации Элека. Прямоугольную полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифте-рийным антитоксином (1000 единиц в 1 мл) помещают на поверхность чашки Петри с агаром, который со-держит 20 % сыворотки крови лошадей; когда агар ещё жидкий. Вместо лошадиной сыворотки можно ис-пользовать сыворотку овец или кроликов. После эту поверхность подсушивают и делают узкие посевы штаммов под прямыми углами к полоскам фильтровальной бумаги. Чашку инкубируют при 37ºС в течение 24-48 часов. Токсины, которые продуцируются бактериями во время их роста, растворяются в агаре и при контакте с антитоксином в оптимальной концентрации проявляется линия преципитации. Наличие таких линий преципитации (в виде головок стрелок) является доказательством токсигенности штамма, отсутствие - наоборот. Этот тест очень удобен и экономен, но следует помнить, что некоторые пептоны и сыворотки непригодны для использования. Тест в культурах тканей. Токсигенность дифтерийных коринебактерий можно продемонстрировать путём нанесения штаммов в агаре на монослой клеточных культур. Токсин, который продуцируют бактерии, диффундирует в клетки и разрушает их. Описано около 15 типов бактериофагов. Типы I и III - это mitis, IV и VI - intermedius, VИИ - невиру-лентный gravis, а другие - вирулентные gravis. Фаготипы являются относительно стабильными. В лабораторной диагностике используют бактериоцины (дифтерицины), молекулярно-генетический метод. 5.2. Материал для самоподготовкиВопросы для самоподготовки врачей-курсантов:
-
Род коринебактерий, морфология, культуральные и биохимические свойства. -
Классификация и дифференциация типов коринебактерий. -
Механизм заражения, патогенез для человека. -
Лабораторная диагностика дифтерии. -
Клинические формы заболевания. -
Патогенез дифтерии, роль токсинов и ферментов в патогенности.
7. Методика постановки РНГА для расчета наличия антитоксического иммунитета.8. Специфическая и неспецифическая профилактика дифтерии.9. Лечение. Схема применения антитоксической противодифтерийной сыворотки.Тесты для самоподготовки:
-
Тест № 1. У больного дифтерией ребенка через 10 дней после введения антитоксической противодифтерийной сыворотки, появились высыпания на коже, которые сопровождались сильным зудом, повысилась температура тела до 38, появились боли в суставах. Какую причину этих явлений Вы предполагаете? -
1) Анафилактическая реакция -
2) Атопия -
3) Сывороточная болезнь* -
4) Гиперчувствительность замедленного типа -
5) Контактная аллергия. -
Тест № 2. В больницу поступил ребенок с диагнозом дифтерия. Какими препаратами для специфической терапии Вы воспользуетесь? -
1) Дифтерийным анатоксином, антибиотиками -
2) Вакциной “Кодивак”, сульфаниламидами -
3) Противодифтерийной антитоксической сывороткой, антибиотиками* -
4) Дифтерийными вакцинами: АКДС, АДС, АД -
5) Дифтерийным бактериофагом. -
Тест № 3. При микроскопии мазка, приготовленного из исследуемого материала от больного ребенка с подозрением на дифтерию и окрашенного по Нейссеру, обнаружены палочки светло-коричневого цвета с темно-синими включениями на концах. Какой структурный элемент микробной клетки выявлен? -
1) Споры -
2) Капсула -
3) Зерна волютина* -
4) Жгутики -
5) Ядерная субстанция. -
Тест № 4. У ребенка с подозрением на дифтерию из зева выделена чистая культура микроорганизмов и изучены их морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства, оказавшиеся типичными для возбудителей дифтерии. Какое исследование необходимо еще провести для выдачи заключения о том, что выделена патогенная дифтерийная палочка? -
1) Определение токсигенных свойств* -
2) Определение протеолитических свойств -
3) Определение уреазной активности -
4) Определение цистиназной активности -
5) Определение способности расщеплять крахмал.
-
Практическая часть для самоподготовки: -
1. Изучение морфологии и ферментативных свойств возбудителей дифтерии. Промикроскопируйте и зарисуйте окрашенные по Граму мазки из зева людей с подозрением на дифтерию. -
2. Произведите посев материала на среды для получения изолированных колоний. Запишите в рабочую тетрадь проделанную работу. -
3. Оценить ферментативную активность коринебактерий на среде Ресселя, пестрому ряду Гисса. -
4. Учесть чувствительность к антибиотикам. -
5. Учесть реакцию РНГА для определения антитоксического иммунитета. -
6. Исследование чистой культуры коринебактерий на токсигенность. Запишите предварительный ответ в графу «Результат».