Файл: Научные ведомости серия Медицина. Фармация. 2010. 10 (81). Выпуск 10 5 обзорные статьи.pdf

НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2010. № 10 (81). Выпуск 10
_______________________________________________________________
5
ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ
УДК 611.7
СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ОБ ОСТЕОИНДУКТИВНЫХ МЕХАНИЗМАХ
РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ. ОБЗОР СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ

Л.А. Павлова
Т.В. Павлова
А.В. Нестеров
Белгородский
государственный
университет
e-mail:
Lpavlova@bsu.edu.ru
В статье изложены данные о механизмах регенера- ции костной ткани, роли остеоиндуктивных факторов в этих процессах. Обзор материалов для пластики дефектов костной ткани и предъявляемые к ним требования.
Ключевые слова: регенерация, остеоиндукция, кост- ные морфогенетические факторы.
Для замещения врожденных или приобретенных дефектов костной ткани при реконструктивных операциях используются различные материалы как биологическо- го, так и не биологического происхождения. При этом одной из важнейших проблем является восстановление костной ткани в зоне замещения. Длительное время опти- мальным материалом для больных с костной патологией не без основания считали ау- токость. Однако использование ее сопряжено с рядом сложностей: ограниченностью донорских ресурсов, опасностью возникновения переломов в месте забора аутотранс- плантатов или инфицирования при их взятии. По данным некоторых авторов [6], час- тота различных осложнений после манипуляций с аутотканями достигает 20,6%. Аль- тернативой аутопластическому материалу могут стать биологические неаутогенные имплантаты, которые после помещения в область костных дефектов постепенно заме- щались бы собственными тканями реципиента, а процессы перестройки в них проте- кали бы в основном так же, как в аутоткани [5].
До недавних пор основным аллогенным костным пластическим материалом в
России были замороженные кортикальные аллоимплантаты, консервированные пара- ми формалина [7]. Для своего времени их появление было настоящим прорывом в соз- дании костных имплантатов с относительно низкими иммунными свойствами и дли- тельным сроком хранения. Большое число больных были вылечены благодаря исполь- зованию замороженных аллоимплантатов. Однако за почти полувековую историю применения этого типа пластического материала выявились и его недостатки: дли- тельный процесс формирования регенерата по типу "ползущего замещения", случаи нагноения, токсический эффект формалина, используемого при консервации имплан- татов с одновременной стерилизацией. Не обладая остеоиндуктивными свойствами, эти имплантаты часто или резорбировались без образования регенерата, или длитель- ное время оставались неизменными, лишь по периферии срастаясь с окружающими тканями.

Работа выполняется в рамках Гранта ФЦП №02. 552. 11. 70. 32.

НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2010. № 10 (81). Выпуск 10
_______________________________________________________________
6
В современной имплантологии можно выделить несколько уровней технологи- ческих разработок в изготовлении биопластических материалов, в данном случае ко- стных алло- и ксеноимплантатов [10, 11]. Так I уровень не предусматривает глубокой переработки донорских тканей. На этом уровне ткани или забираются в асептических условиях и консервируются низкими температурами, либо очищаются, обезжиривают- ся и обрабатываются химическими реагентами, достигая тем самым одновременной консервации и стерилизации [25]. На II уровне ткани подвергают более серьезной об- работке. Примером может служить процесс изготовления деминерализованных кост- ных аллоимплантатов, где в костной ткани с помощью декальцинации растворами ки- слот меняют соотношение минерального и органического компонентов. В таких случа- ях материал приобретает наряду с остеокондуктивными и дополнительные остеоин- дуктивные свойства. При этом деминерализация кости может быть поверхностной, частичной или полной. В зависимости от степени декальцинации материал имеет раз- ные механические и пластические характеристики, что дает хирургу возможность ком- бинировать материалом в зависимости от конкретной клинической ситуации [3].
III уровень предполагает создание биокомпозиционных материалов, содержа- щих как основные компоненты костной ткани, так и биоактивные субстанции. К по- следним относятся факторы роста, морфогенетические белки и другие компоненты ко- стного матрикса. Биоактивным субстанциям отводят роль активаторов и регуляторов физиологической регенерации тканей. Кроме того, на стадии имплантации в состав таких материалов могут быть включены и трансплантируемые различные клетки- предшественники. В настоящее время создание биокомпозиционных материалов в
России приобрело приоритетный характер [8].
Биоматериалы, претендующие на роль имплантатов, должны удовлетворять требованиям, диктуемым описанной выше структурой, составом и свойствами костной ткани:
1) химические свойства – отсутствие токсичности и нежелательных химических реакций с тканями и межтканевыми жидкостями, отсутствие коррозии;
2) механические характеристики биокерамики должны быть близкими к тако- вым для кости (например, различие в упругости может привести к утрате имплантата вследствие резорбции находящегося с ним в контакте костного вещества);
3) биологические свойства – отсутствие реакций со стороны иммунной системы организма, срастание с костной тканью, стимулирование процесса образования кост- ной ткани (остеосинтеза);
4) для быстрого прорастания костной ткани в имплантат необходимо наличие в последнем сквозных пор размером 100-150 мкм. (В.И.Путляев. Современные биокера- мические материалы.)
Новые перспективы в импланталогии открылись благодаря разработке и вне- дрению в клиническую практику конструкций из высокочистого титана, обладающего ценными физико-химическими и физико-механическими характеристиками — биоло- гической инертностью, коррозионной устойчивостью, отсутствием токсичности, высо- кой механической прочностью, пластичностью и малым удельным весом. Титановые пластины не являются ферромагнитными и позволяют проводить контрольную рент- генографию, компьютерную и магнитно-резонансную томографию в послеоперацион- ном периоде. Использование этого материала при конструировании эндопротезов имеет ряд существенных преимуществ перед другими металлами и сплавами, содер- жащими ванадий и молибден, которые подвергаются коррозии в биологической среде из-за наличия в ней электролитов. Наиболее удачными считались сплавы на основе кобальта, никеля, хрома, молибдена, но и они со временем разрушаются в биологиче- ских системах. Кроме того, эти металлы недостаточно пластичны, сложны в обработке и очень дороги. Один из этапов в развитии применения металлоконструкций для за- мещения костных дефектов — нанесение на поверхность металлов слоя гидроксиапа- тита с целью улучшить скрепление поверхности имплантата с окружающими тканями организма за счет врастания их в гидроксиапатитный слой. Наряду с использованием гидроксиаппатита наносятся дополнительные слои органических соединений, усили-

НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2010. № 10 (81). Выпуск 10
_______________________________________________________________
7 вающих регенераторно-репаративные процессы. К таким соединениям относятся кол- лаген и факторы роста [31].
К настоящему моменту выявлено свыше 30 ростовых факторов, при этом наи- более изучены следующие факторы роста, способствующие регенерации тканей:
1) тромбоцитопроизводный фактор роста (PDG F); 2) фактор роста эндотелия сосудов
(VEG F); 3) трансформирующий фактор роста (TGF-Р); 4) кислый и основной факторы роста фибробластов (aFGF и bFGF); 5) инсулиноподобный фактор роста типа I и II
(IG F); 6) эпидермальный фактор роста (EG F). Особенно большое значение для реге- нерации костной ткани имеют TGF-Р, представляющие собой большую группу белков, среди которых TGF-Р1 и морфогенетические белки кости (BMPs) модулируют клеточ- ную пролиферацию, дифференцировку малодифференцированных клеток в остеобла- сты, увеличивают синтез внеклеточного матрикса кости и ингибируют его деградацию, продуцируют иммуносупрессорный эффект [1,9,23].
Костные морфогенетические белки (Bone morphogenic protein) – КМБ(BMP) – являются димерами и удерживаются вместе критическим межмолекулярным дисуль- фидным сцеплением. Димерная структура является критической для костной индук- ции и морфогенеза. Каждый из двух мономеров синтезируется в виде первичной моле- кулы, содержащей более чем 400 аминокислот [30].
Однако, зрелый мономер морфогенетического белка кости, получаемый в про- цессе расщепления белка, является пептидом, состоящим примерно из 120 аминокис- лот. Морфогенетические белки кости – это плеотропные молекулы. Плеотропия – это свойство гена или белка действовать посредством многоэтапного процессинга. Морфо- генетические белки кости действуют через три главных этапа последовательно с кост- ным морфогенезом, то есть хемотаксис, размножение и дифференциация временной хрящевой основы и постоянной костной индукции. КМБ принадлежат группе цитоки- нов, относящихся к основному подклассу трансформирующих факторов роста. Извест- но, что они способны индуцировать рост костной ткани, а именно воздействовать на пролиферацию и дифференцировку четырех типов клеток – остеобластов, остеокла- стов, хондробластов и хондроцитов. Кроме этого, морфогенетические белки блокируют миогенез и адипогенез. Показано, что остеобласты и клетки стромы костного мозга экспрессируют рецепторы КМБ I и II типов. Обработка их КМБ в течении 4-х недель вызывает минерализацию матрикса, повышение активности щелочной фосфатазы и концентрации мРНК. Показано, что КМБ распределен по коллагеновым волокнам ко- стной ткани, в клетках остеогенного слоя надкостницы.
Рекомбинантный человеческий костный морфогенентический белок-2 (рчКМБ-
2) представляет собой остеоиндуктивный фактор, который играет основную роль в процессе роста и регенерации костной ткани. Полученный в рекомбинантной форме, он продемонстрировал в эксперименте чёткую остеоиндуктивную активность, доста- точную для обеспечения сращения при ортотопической имплантации. E.A. Wang с со- авторами, по-видимому, были первыми, кто показал возможности рчКМБ-2 индуци- ровать костеобразование, когда в качестве носителя использовался неактивный деми- нерализованный крысиный костный матрикс.
Для проверки остеоиндуктивной способности рчКМБ-2 при ортотопической имплантации A.W. Yasko с соавторами сформировали сегментарные 5-миллиметровые дефекты в бедренных костях 45 крыс-самцов. Две дозы (большая и малая) лиофилизи- рованного рчКМБ-2 (1,4 и 11,0 мкг) имплантировали в каждый дефект вместе с неак- тивным деминерализованным матриксом кости крысы в качестве носителя. Результа- ты сравнивали с опытами на крысах, которым имплантировали только неактивный ко- стный матрикс. Образование новой кости и заживление дефекта контролировали рент- генографическим, гистологическим и механическим путями. Было установлено, что уже на 7 день после операции имелись рентгенологические признаки костеобразова- ния у крыс, получивших большую дозу. Признаки костного сращения были отмечены уже на 3 неделе после операции. Через 9 недель установлены достоверные различия рентгенологических признаков консолидации между группой животных, которым им- плантировали большое количество рчКМБ-2 и двумя другими группами. У крыс, полу-

НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2010. № 10 (81). Выпуск 10
_______________________________________________________________
8 чивших малую дозу, рентгенологические изменения начали прослеживаться не ранее
3-4-ой недели после операции. При отсутствии рчКМБ-2 неактивный деминерализо- ванный матрикс крысиной кости вообще не индуцировал сколь либо заметного косте- образования. Гистологические исследования подтвердили рентгенологические дан- ные. Авторы установили, что образующаяся новая кость морфологически неотличима от продуцируемой аутологичным костным трансплантатом и активным деминерали- зованным костным матриксом. При испытании на механическую прочность бедренные кости после имплантации большой дозы рчКМБ-2 демонстрировали ригидность, срав- нимую со здоровой бедренной костью. Таким образом, работа убедительно проде- монстрировала способность рчКМБ-2 индуцировать остеогенез при ортотопической имплантации у крыс, а также зависимость эффекта остеоиндукции от времени с мо- мента имплантации и дозы остеогенного фактора.
M.P.G. Bostrom с соавторами изучали влияние рчКМБ-2 на заживление дефекта локтевой кости у 60 кроликов. В качестве носителя использовали абсорбирующую коллагеновую губку. Восстановление костной структуры оценивали рентгеноло- гическим и биомеханическим методами в сроки от 2 до 6 недель после операции. Жи- вотные были разбиты на три тест-группы: 1) рчКМБ-2 с коллагеновым носителем; 2) один коллагеновый носитель; 3) контрольная группа без применения имплантатов. Пересажи- ваемый материал укладывали в место остеотомии таким образом, чтобы не повреждалась межкостная мембрана. Результаты оценивали через 2, 3, 4 и 6 недель. Опыты показали, что образующаяся костная мозоль, схожая по всем рентгенологическим и биомеханиче- ским показателям с интактной костью, появляется у животных с пересаженным рчКМБ-2 к концу 4 недели. В контрольной группе и в группе, где применялась коллагеновая губка, полноценная мозоль образовалась только через 6 недель.
Особенно большой объём экспериментальных работ за рубежом посвящен ис- пользованию остеогенных факторов роста при ортопедических операциях на позво- ночнике. Так, H.S. Sandhu с соавторами изучали действие рчКМБ-2 при операциях на позвоночнике у собак. Цель вмешательства заключалась в создании анкилоза между поперечными отростками позвонков. Авторы установили, что доза остеогенного фак- тора является одним из важных моментов при выполнении подобных вмешательств. В дальнейшем они показали, что при использовании КМБ отпадает необходимость про- изводить декортикацию кости. Было также выявлено, что остеогенная активность рчКМБ-2 (в качестве носителя служила полимолочная кислота) была выше, чем у ау- тотрансплантата, взятого из крыла подвздошной кости. Применяемые дозы белка от
57мг до 2,3 мг приводили к 100%-ному сращению через 3 месяца после операции, тогда как аутотрансплантаты не давали подобного эффекта в те же сроки. Кроме того, авто- ры отметили, что образующаяся костная мозоль была более прочной при использова- нии больших доз рчКМБ-2 [14, 16, 21, 29].
Похожие результаты были получены J.H. Schimandle с соавторами на 45 белых кроликах, которым после ламинэктомии выполнялся артродез поперечных отростков.
Авторы использовали рчКМБ-2 в разных дозах, а в качестве носителя применяли гид- роксиапатит. Контрольную группу составляли животные, которым пересаживалась ау- токость. Результаты оценивались механическим, рентгенологическим и гистологиче- ским методами. Исследователи также пришли к выводу, что лучшее сращение достига- ется при максимальных дозах КМБ [24, 26].
Интересный опыт был поставлен J.M. Lane с соавторами. Они предположили, что сочетание рчКМБ-2 и костного мозга в качестве единого трансплантата может ока- зать более выраженное остеогенное действие по сравнению с изолированным исполь- зованием каждого из них.
Крысам формировали 5-миллиметровый дефект диафиза бедренной кости. Все животные были разбиты на 5 групп. В первой группе в ефект бедренной кости переса- живали рчКМБ-2 вместе с костным мозгом; во второй использовали только рчКМБ-2; в третьей – костный мозг; в четвертой – губчатый аллотрансплантат, в пятой – коллаге- новый носитель. Рентгенологический контроль выполняли через 3, 6, 9 и 12 недель.
Тест на механическую прочность производили через 12 недель после операции. Ре-

НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2010. № 10 (81). Выпуск 10
_______________________________________________________________
9 зультаты опытов показали, что комбинация рчКМБ-2 и костного мозга давала костное сращение в 100% случаев через 6 недель, рКМБ-2 самостоятельно приводил к костному сращению в 80% случаев через 12 недель. В этот же срок костное сращение при пере- садке цельного трансплантата происходило только в 38% случаев, одного костного мозга – в 47%, а коллагеновый носитель вообще не вызывал сращения. Данное иссле- дование подтвердило важность биологического синергизма при взаимодействии ос- теогенных факторов и прогениторных клеток, поставляемых из костного мозга.
Экспериментальные разработки показали, что индуцируемая рчКМБ-2 костная ткань соответствует анатомическому месту пересадки и биологически функционирует как нативная кость, отвечая всем нормальным гистологическим, биомеханическим и рентгенологическим критериям. Исследования продемонстрировали, что процесс кос- теобразования, индуцируемый рКМБ-2, склонен к самоограничению, которое можно объяснить постепенным исчезновением остеогенного белка из места пересадки, при- сутствием ингибиторов КМБ в окружающих тканях, а также действием молекулярных механизмов отрицательной обратной связи [12, 18, 28].
Одним из важнейших условий применения остеогенного фактора in vivo являет- ся способ его доставки к месту назначения, поскольку максимальная сохранность КМБ играет решающую роль для его оптимальной биологической активности. По этой при- чине любой костный морфогенетический белок чаще всего комбинируют с каким-либо материалом, который самостоятельно, как правило, не проявляет остеоиндуктивного действия. Роль матрикса в данном случае, по-видимому, заключается в том, что он за- медляет диффузию белка или привлекает к себе соответствующую клеточную популя- цию с последующей адгезией и пролиферацией этих клеток. Следовательно, матрикс является как бы субстратом для клеточного роста и дифференцировки. Не исключено также, что идеальный тип носителя может зависеть не только от анатомических осо- бенностей места, куда пересаживается КМБ, но и от структуры самого матрикса. На се- годняшний день наиболее распространёнными носителями для КМБ являются: колла- геновые материалы, деминерализованный костный матрикс, различные биодегради- рующие синтетические полимеры.
У человека КМБ впервые был использован M.R. Urist с коллегами в клинике Ка- лифорнийского университета в Лос-Анжелесе в начале 80-х годов. Авторы применили аутолизированную антигенэкстрагируемую аллогенную костную ткань (ААА), насы- щенную КМБ и неколлагеновыми белками, и подвергнутую лиофилизации. Содер- жание КМБ в таком трансплантате было 10-15 мг на 1 г аллокости. Остеоиндуктивная активность каждого трансплантата была подтверждена при эктопической пересадке в мышцу у мышей[13, 17, 19, 27].
Всего в период с 1983 по 1992 гг. 28 пациентов было подвергнуто оперативному вмешательству, в основном с несращениями большеберцовой, бедренной и плечевой костей. В результате лечения у 26 человек сращение было достигнуто после первого же вмешательства, у 2 больных потребовались повторные операции, которые в итоге так- же привели к положительному исходу. Ни в одном из наблюдений не было отмечено каких-либо послеоперационных осложнений. В дальнейшем данный метод с успехом был использован авторами при лечении различных видов несращений и ложных сус- тавов бедренной кости, сопровождающихся укорочением конечности[20, 22].
Таким образом, из всего сказанного можно заключить, что остеогенные белки должны играть важную роль в системе лечения различной костной патологии у чело- века. Созданные с помощью генной инженерии рекомбинантные формы КМБ, оказа- лись способными обеспечивать результаты, эквивалентные тем, которые получают при использовании костных аутотрансплантатов.
В лаборатории наноструктурных исследований в медицине Белгородского госу- дарственного университета проходят исследования по изучению остеоиндуктивных, биоактивных свойств костной ткани при применении наноструктурированных им- плантов, нанопокрытий и костных морфогенетических белков.