ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 12.01.2024
Просмотров: 85
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Дәріс 6. Клондау технологиясында гендік кітапханаларды құру және скрининг жасау әдістері
"Хромосомада секіру" әдісі бойынша клондау технологиясының ерекшелігі әр түрлі мыңдаған нуклеотидтердің ара қашықтығын анықтамай -ақ бөліп алуға мүмкіндік береді. «Хромосомадан секіру» әдісі бойынша гендер кітапханасын жасау, геномдық ДНҚ-ны сирек-сіңіретін шектеу ферменттерімен шектеу (әдетте, шектеу учаскелері шамамен 200 кб қашықтықта орналасқан ең ыңғайлы фермент секіргіш ұзындығы болып табылады). Бұл фрагменттер кішкентай маркерлік геннен, әдетте, supF генімен (ұзындығы = 7 кб) Х фаг арқылы, циклизацияланалы. Нәтижесінде, соңғы өңірлер бастапқыда бірнеше жүз кб қашықтықта. бір-бірінен тек маркер генінің ұзындығымен жойылады. Сақина молекулаларын рестриктаза ферменті арқылы байланыстыруды шектеу (көбінесе EcoR1-ні қолданып) кезінде маркер генін және оның флангиялық тізбектерін қоса алғанда ұзындығы шамамен 20 кбит / с фрагменттер таңдалады. Векторға енгізілгенде, осы генді қамтитын тек дәйекті теріс маркер генінің қабылдаушы жасушаларында күшейтіледі. Содан кейін клон бастапқы дәйектілікке тән ДНҚ зондымен будандастыру арқылы анықталады. Кейінгі субклондау кезінде плазмидті векторда екі субклинон алынды. Бір субклон бастапқы дәйектілікке тән ДНҚ зондымен будандастырады, екіншісі - осы ДНҚ зондымен будандастырылмайды және секірудің ұзындығы бойынша бастапқы молекуланың шыққан бөлігінен бөлінетін ДНҚ фрагменті бар. ДНК-ның үлкен фрагменттері бар геномдық кітапханаларды құрастырғаннан кейін, және карталарының құрастырылу кезінде «жаяу» және «хромосомадан секіру» әдістері өзектілігін жояды. https://medicalplanet.su/genetica/139.html
Дәріс 7. Молекулалық клондауда ген дозасының әсері
Классикалық генетикада геннің дозасының әсері жақсы белгілі, белгілі бір геннің көшірмелерінің санының организмнің геномының ұлғаюы оның протеиндік өнім деңгейінің пропорционалды өсуіне әкеледі. Гендік инженерия әдіснамасының пайда болуымен геннің доза әсері клондалған гендердің ақуыз өнімдерінің кірістілігін арттыру жолындағы алғашқы қадам болды. Геннің жоғары дозасы фагтардың және плазмидалардың ДНҚ-на негізделген E. coli жасушалары үшін жасалған бірнеше көшірме векторларын пайдалану арқылы қол жеткізіледі. Мультикопиялы плазмидті векторларды құру үшін плазимидтер репликалауды әлсіреуі немесе идентификациялау функциясына сәйкес жылу сезімтал мутациялармен бірге қолданылады. Бірінші типтегі векторлардан ColEl плазмид пен оның көптеген туындылары (2.2.1-ні қараңыз) кеңінен 20-60 данадағы жасушада кеңінен қолданылған. Тіпті бірінші гендік-инженерлік жұмыстарда Типтофан синтезінде A және E. coli антранилат синтетазаны ColEl плазмидасына гендердің құрамына кіретін ДНҚ фрагменті енгізілгеніне қарамастан, осы ферменттердің белсенділігінің деңгейін 40 және 18 есеге арттырып, жабайы штамммен салыстырғанда түрі: гибридті плазмидтің көшірмесі бұл жағдайда шамамен 25 молекула болатын. рМВ9 плазмидіндегі sbcB + генін қамтитын ДНҚ фрагменті клондау арқылы E. coliде экзонуклеаза I белсенділігінің деңгейінің 25 есе ұлғаюына қол жеткізілді, егер dnaB, dnaC, dnaE және dnaZ гендері бар E. coli хромосомалық үзінділері бірдей векторға енгізілген болса көшірме қуаттылықтың өсуі есебінен тиісті ақуыздарды өндіру 3-10 есе артты. http://bookzie.com/book_347_glava_63_5.8.7._PRAVO_NA_FIRMENNOE_NAIM.html
Дәріс 8. Экспрессия деңгейіндегі клондалған гендердің транскрипция тиімділігінің әсері
Клондалған генмен анықталған ақуызды өндіру деңгейі осы геннің кодтау дәйектілігінің транскрипциясы тиімділігіне үлкен әсер етеді. ДНҚ транскрипциясы фермент РНҚ полимеразы арқылы жүзеге асырылады. E. coli жасушасында осы ферменттің шамамен 3 мың молекуласы бар. E. coli RNA полимеразы - бірнеше түрлі бөліктен тұратын күрделі белоктар: β '(156 кДа), β (151 кДа) және (37 кДа) және o (молекулярлық массалар әртүрлі кр-субуництер үшін әр түрлі). Фермент молекуласындағы қосалқы заттар ковалентті байланыстарсыз біріктіріледі. Бұл комплекстегі cг-бөлімшесінде ең аз шектелген. Ерекше ферментативті белсенділік формуласы кор-фермент деп аталады . РНК полимеразының осы формасы E әрпімен белгіленеді. Еркін күйде фермент толық RNA полимераза емес, өйткені геннің транскрипциясын бастау ДНҚ сигналдарын дұрыс тани алмайды. O-бөлімшесі ферментпен біріктірілген кезде, / 3 '/ S03 формуласы бар голоцензия (Eo) құрылады. Σ-субуниті немесе o-факторы голоциздердің ДНҚ-ның белгілі бір аймақтарымен байланысының ерекшелігін қамтамасыз етеді. EO негізгі байланыстыратын ДНҚ тізбектері орын алады және ДНҚ-ның бірін толықтыратын РНК тізбегін синтездеудің бастамасы промоторлар деп аталады. http://bookzie.com/book_347_glava_64_5.9._OBSHHIE_POLOZHENIJA_OB_OB.html
Дәріс 9. ДНК клондау үшін гендік инженерияның векторлары
Ген клондау - алушы жасушаларда, пропорционалды және эукариотттағы жеке гендерді оқшаулау мен күшейтуді қамтитын процедура. Қажетті генді қамтитын бұл жасушалар: а) генмен кодталған ақуыздың үлкен мөлшерін; б) жоғары дәрежеде тазартылған түрдегі гендер қолданылады.
Ген клондау процесі бірнеше кезеңдерді қамтиды:
-
Қажетті генді алу:
а) эндонуклецияны шектеу арқылы геномдық ДНҚ-ның бөлінуі (қатаң анықталған жерде ДНҚ молекуласының эндонуклеациялау;
б) тек кішкентай ДНҚ үзінділерін химиялық синтездеу арқылы (өйткені белок молекуласындағы амин қышқылының қалдықтарының тізбегін білу арқылы әрдайым генетикалық кодқа сәйкес ақуызды кодтайтын ДНҚ фрагментіндегі нуклеотидтің дәйектілігін анықтай алады). Осылайша, химиялық синтездеу жолымен соматостатинді синтездеуге жауап беретін ген алынады;
в) мРНК молекулалары дене жасушаларынан оқшауланады және кері транскриптаз ферменті (РНҚ-тәуелді ДНҚ-лимазид) көмегімен қажетті геннің ДНҚ көшірмелері жойылады. Мысалы, ұйқы безі жасушаларының инсулин синтезі туралы ақпаратты алып жүретін мРНК оқшауланған. Ал вирустармен зарарланған клеткалардан РНК-да оқшауланған, олар интерферон синтезі туралы ақпаратты қамтиды.
2. ДНҚ молекуласының композициясына оқшауланған немесе алынатын ДНҚ фрагментін енгізу - рекомбинантты ДНҚ алу. Вектор молекулярлық «такси» сияқты, мысалы, ДНК-ны бактериялық жасушаның ішіне көшіре алатын етіп жасай алады. Векторлардың екі негізгі түрі бар: бактериялық плазмидалар (көбіне екі немесе одан да көп антибиотиктерге төзімділік үшін жауапты) және қалыпты (трансекцияға қабілетті) бактериофагтар.
Дәріс 10. Эукариоттардың құрылымдық гендерін клондау
Гендердің құрылымы мен функцияларын зерттеудегі заманауи кезеңнің жетістіктері гендік-инженерлік технологияларды дамыту және кеңінен қолдану, соның ішінде түрлі организмдердің ДНҚ фрагменттерін (гендерін) клондау әдістері. Молекулалық клондау үшін фосфодиэфирлік байланыстарының бұзылуымен және молекуланың сызықты фрагменттерінің қалыптасуымен ДНҚ молекуласының нақты нуклеотидтік тізбектерін жабуға болатын («қиып алу») эндонуклеотидтерді (шектеу ферменттері) шектеуі мүмкін ферменттер пайдаланылады. Клондалған гендердің тасымалдаушылары (векторлары) ретінде әдетте вирустардың немесе бактериялық плазмидалардың кіші дөңгелек ДНҚ молекулалары пайдаланылады. Мысалға, 6-нуклеотидті инверттелген дәйекті (5'-GAATTC-3 'бір жолақ және 3'-CTTAAG-5' екіншісі) біріктіретін ДНҚ молекуласының сегменттерін «тану» қабілетті EcoR1 шектеу энзимінің әрекеті; молекуланың әрқайсысының Г және А нуклеотидтерінің арасындағы үзілістерді енгізіңізеді. Осы талшықтарды әрі қарай бөліп алу молекуланың қалыптасқан фрагменттерінің бірқалыпты («жабысқақ») ұштарының пайда болуына әсер етеді, алайда молекуланың құрылымын қалпына келтіруге қабілетті лигаза ферменттерінің көмегімен қосымша принцип бойынша оңай біріктіруге болады. https://megalektsii.ru/s511t9.html
Дәріс 11. Полимеразды тізбекті реакция (ПТР)
Әдістің қағидасы. ПТР әдісінің негізінде зерттеліп отырған түрдің ДНҚ-ның сол түр үшін айрықша белгі болып саналатын тәнді бөлігін (фрагментін) еселеп көшірмеден (амплификация) өткізіп алу жатыр. Мұндай көшіруді дезоксирибонуклеозид-трифосфаттардың (дНТФ) және праймерлер деп аталатын ДНҚ синтезінің жасанды олигонуклеотидтерінің қатысуымен термостабилді ДНҚ-полимераза ферменті жүзеге асырады. Праймерлер ДНҚ-ның тәнді бөлігімен комплементарлы болып келеді және ДНҚ синтезі тек солардың арасында ғана өтетіндей етіп бағытталған. Нәтижесінде ДНҚ-ның бізге қажетті бөлігінің көшірмелерінің саны көбейе береді. Әр цикл үш кезеңнен тұрады. Әр кезеңнің белгілі бір температуралық режимі болады.
1) ДНҚ-ның қос спиралінің тарқатылуы (ДНҚ денатурациясы) 63-95 0 С-та жүзеге асады.
2) Праймерлердің ДНҚ бөлігіне қосылуы комплементарлы түрде праймерлердің сол жұбына тәнді температурада жүзеге асады.
3) ДНҚ-ның жаңа тізбегінің синтезі 72 0 С температурада жүзеге асады. Көшірудің (амплификацияның) 30-35 циклынан кейін ДНҚ бөлігінің 10 көшірмесі дайын болады., ал бұл өз кезегінде агарлы гелдегі электрофорезден кейін реакция нәтижесін көзбен көруге мүмкіндік береді. https://medlec.org/lek-27062.html
Дәріс 12. Биотехнологиялық өндірістерде рекомбинантты микроорганизмдерді пайдалану.
Белок өнімдерін алудан басқа, гендік инженерия жетістіктері түрлі құнды молекулярлық ақуыздық емес қосылыстар - витаминдер, аминоқышқылдар, антибиотиктер алуда аса маңызды болып табылады. Біріктірілген ДНҚ технологиясын қолдану арқылы микроорганизмдердің метаболизмін өзгертуге, жаңа гендерді енгізуге немесе қолданыстағыны түрлендіруге болады. Осындай өзгерістердің басты мақсаты - қолданыстағы субстратты әдетте химиялық және микробиологиялық әдістердің комбинациясы арқылы алынған құнды өнімге айналдыруға қабілетті жаңа ферментативті белсенділігі бар рекомбинантты микроорганизмді құру. https://poznayka.org/s83172t1.html
Дәріс 13. Өсімдіктердің қоректік маңызын арттыруда гендік инженерия технологиясын қолдану.
Өсімдіктердің метаболизмі инженериясы сыртқы гендерді енгізу немесе қабылдаушы жасушаның генін модификациялау жолымен жаңа биохимиялық реакциялардың трансгендік жасушасын жасауға бағытталған. Өсімдіктер метаболизмге арналған ең қолайлы объектілердің бірі болып табылады. Негізгі биологиялық қосылыстарды синтездеудің жолдары бірдей болғанымен, олардың соңғы өнімдері таңқаларлық әртүрлілігімен ерекшеленеді: қант, хош иісті қосылыстар, май қышқылдары, стероидті қосылыстар және басқа да биологиялық белсенді заттар. Өсімдіктер ондаған, мыңдаған табиғи өнімдерді береді, олардың көпшілігі фармакология мен өнеркәсіп үшін құнды болып табылады. Кейбір маңызды дәрі-дәрмектерді өндірушілер - бұл әлемнің көптеген дамыған елдерінің қалыпты климаттық аймақтарында ауылшаруашылық өндірісіне қол жеткізе алмайтын бірегей тропикалық және эндемикалық өсімдіктер. Арнайы органикалық қосылыстардың бағытталған синтезін анықтайтын және оларды тиісті өсімдіктерге көшіруді анықтайтын гендердің осындай өсімдіктерінен оқшаулануы оларды маңызды биологиялық белсенді заттардың жаңа өндірушілеріне айналдырады. Көптеген өсімдіктер құнды биологиялық қосылыстардың биосинтезінің прекурсорларын қамтиды, бірақ олардың осы қосылыстарға айналуы үшін ферменттер жоқ. Жиі метаболиздік техника үшін, клеткаға бір ғана генді ауыстыру жеткілікті. https://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/oblasti-primeneniya-gennoy-inzhenerii-rasteniy/
Дәріс 14. Бағалы биологиялық активті ақуыздарды өндіруші ретінде қолданылатын трансгенді жануарлар.
Ауыл шаруашылық биотехнологиясының маңызды міндеттерінің бірі трансгендік жануарларды өсіру болып табылады, бұл өнімділігі жоғары және ауруларға төзімділік және құнды биологиялық белсенді заттардың өндірушілері деп аталатын жануарлардың биореакторларын жасау болып табылады. Генетикалық тұрғыдан өсу гормонын, ақуыздарды кодтайтын гендер: өсу гормоны (GH), өсу гормонын босату коэффициенті (РФ) және инсулинмен ұқсас GH факторы (GFRD) ерекше қызығушылық тудырады. ХХ ғасырдың 70-жылдарының соңында жануарлардың өсу гормонының гені E. coli геномына біріктірілген. E. coli-ден оқшауланған GH жануарлардың лактациясына және өсіміне, сондай-ақ гипофиз ГХ-ға әсер ететін ынталандырушы әсеріне ие екендігі көрсетілді. Генетикалық инженерия әдістерінің көмегімен кең масштабты қолдану арқылы алынған өсім гормоны тәулігіне 13 мг дозада сүт өнімділігін 23-31% -ға арттырды. Әр екі аптада бір рет және тіпті айда бір рет қолдануға мүмкіндік беретін ұзартылған әрекетті дайындаудың формалары әзірленеді. ГР-дың күнделікті инъекциясымен жас малды, шошқа мен қойлар күнделікті салмақтың өсуін 20-30% -ға ұлғайта алды, бұл өсім бірлігіне азық-түлікті тұтынудың айтарлықтай төмендеуімен болды. Шошқаларды өсіруде ақуыз мөлшері артып, тіндердегі майдың мөлшері азайды, бұл ет өнімдерінің сапасын арттырды. https://helpiks.org/4-85697.html
Дәріс 15. Прокариоттардың генетикалық трансформациясы
Фитопатогендер өсімдіктерде белсенді болған кезде қорғаныш реакцияларының механизмдері енгізіледі. Бұл жағдайда өсімдіктерде белсенді жауаптар екі негізгі бағыт бойынша жүзеге асырыла алады: біріншіден, инфекцияға жауап ретінде, уландырғыш заттардың синтезі басталады және патогендердің өмірлік белсенділігін шектейді, нәтижесінде олар тіршілігін жояды болады. Екіншіден, қорғаныс әрекеті ретінде өсімдіктердің зақымдануын және өсімдіктердің жасуша қабырғаларының лигнизациясы арқылы қол жеткізуге болатын немесе гидрокипролинге және басқа қосылыстарға бай гликопротеиндердің есебінен жасуша қабырғаларын нығайтуға жол бермейтін құрылымдық кедергілер жасалуы мүмкін, бұл фитопатогендердің зақымдануына әкеледі. Вирустармен, бактериялардан және саңырауқұлақтардан инфекцияға жауап ретінде, ең көп зерттелген хитиназдарды және β-1,3-глюканаздарды қоса алғанда, ерекше PR-ақуыздары (патогенезбен байланысты белоктар)атап өтуге болады. Бұл ферменттер саңырауқұлақтардың өсуін, сондай-ақ бактериялардың кейбір түрлерін тоқтатады. Хитиназ және глюканаза ақуыздарының фунгицидтік әсері, сондай-ақ оларды бірыңғай гендер арқылы кодтау эксперименталды түрде дәлелденді. Сондықтан, хитиназ және глюканаз гендері фитопатогендерге төзімді трансген өс імдіктерін алу үшін гендік инженерияда қолданылады. https://helpiks.org/8-88506.html