Файл: КЛ_фер_вит.doc

Оптимум pHдействия большинства ферментов лежит в слабокислой или нейтральной реакции среды.

Таблица 2 – Оптимальные значения pHдля некоторых ферментов

pHопт

V

pH

V– скорость реакции

Рисунок 3 – Зависимость скорости биохимической реакции от pHсреды

Согласно современным представлениям, влияние изменений pHсреды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности,COOH-группы дикарбоновых аминокислот,SH-группы цистеина,NH₂-группы лизина и т.д.). При резких сдвигах от оптимумаpHсреды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При измененииpHнарушается оптимальное соотношение ионизируемых и не ионизируемых групп (соответствующее наибольшей активности фермента), что сказывается на третичной структуре белка и строении его активного центра. Кроме того, концентрация [H⁺] оказывает влияние на ионизацию субстрата и ионизацию кофактора, что также влияет на скорость течения реакции.

10. Концентрация фермента

Скорость ферментативных реакций зависит от количества фермента в среде. Когда в среде субстрата достаточно, скорость ферментативной реакции возрастает пропорционально увеличению количества фермента. Графически это выглядит следующим образом (рис. 4.):

V

V- скорость реакции

С- концентрация фермента

С

Рисунок 4 – Зависимость скорости реакции от концентрации фермента

Эта зависимость справедлива только в определённых условиях, например, в начальный период ферментативной реакции, т.к. в этот период практически не происходит обратной реакции, а концентрация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции. Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость реакции) будет пропорциональна концентрации фермента.

11. Концентрация субстрата

Скорость ферментативной реакции в сильной степени зависит от концентрации субстрата в среде. При низкой концентрации субстрата скорость реакции возрастает пропорционально его концентрации. Однако по мере увеличения концентрации эта пропорциональность нарушается, скорость реакции растёт всё медленнее. Происходит насыщение фермента субстратом, при этом молекулы фермента находятся в форме ES(полное насыщение), скорость реакции становится максимальной (V_m). Очевидно, что при полунасыщении (т.е. когда половина молекул фермента находится в формеES) скорость реакции равна ½V_m.В этом заключается ещё одна особенность ферментативных реакций, не свойственная реакциям, протекающим в отсутствии ферментов. Если ещё дальше повышать концентрацию субстрата, то скорость реакции достигнет постоянного уровня, становится постоянной, не зависящей от концентрации субстрата. В этих условиях фактором, лимитирующим скорость ферментативной реакции, становится концентрация фермента в среде.

Изучение влияния концентрации субстрата на скорость ферментативных реакций позволило Л. Михаэлису и Ментен создать основы теории ферментативной кинетики.Они вывели классическое уравнение, описывающее гиперболическую зависимость в координатах V-[S]; при увеличении концентрации субстрата скорость ассиметрически стремится кV_m:

Одним из основных выводов этой теории является установление константы Михаэлиса, графическое изображение которой представлено на рис.5. Если скорость реакции при высоких концентрациях субстрата достигает некоторой максимальной величины V_m, то концентрация субстрата [S], при которойV=V_m/2, называется константой МихаэлисаK_m, т.е.K_m=[S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимальной.

Более низкие значения K_mозначают, что ферментативный катализ происходит более интенсивно.

V

V_m/2V_m

S

V–скорость реакции

K_m – концентрация субстрата,

Рисунок 5– Графическое изображение константы Михаэлиса

Таблица 3 – Значение констант Михаэлиса – Ментен (Кm) для катализа ферментом гексокиназой фосфорилирования сахаров.

Как следует из данных таблицы 5, количество глюкозы, необходимое для 50%-го насыщения фермента, в тысячу раз меньше, чем необходимое для 50%-го аллозой. Следовательно, фермент предпочтительнее взаимодействует с глюкозой – он более специфичен к ней (реакция протекает тем быстрее, чем ниже К_m). К_m для маннозы практически равен К_m для глюкозы. Сравнивая структуру субстратов, можно видеть, что отличие аллозы от глюкозы и маннозы, так существенно сказавшееся на величине К_m, и, следовательно, скорости реакции фосфорилирования, обусловлено пространственной ориентацией ОН-группы у третьего (сверху) атома углерода и активного центра фермента, по которому идет образование фермент-субстратного комплекса.

12. Активаторы и ингибиторы ферментов

Активаторами называют вещества, которые повышают активность ферментов. Примером таких соединений являются аминокислота цистин и восстановленный глютатион, содержащие свободную –SH-группу. Их активирующее действие заключается в том, что они восстанавливают дисульфидные связи с образованием –SH-групп, необходимых для проявления каталитической активности тиоловых ферментов. Кроме того, некоторые ферменты активируются металлами, которые либо участвуют в построении активного центра, либо стабилизируют пространственную конформацию ферментного белка и тем самым обеспечивают проявление каталитических функций. Активность фермента α-амилазы слюны человека повышается в присутствии анионовClˉ.

Ингибиторы замедляют скорость биохимических реакций, а в ряде случаев полностью приостанавливают её. Процесс ингибирования может быть обратимым и необратимым. При необратимом ингибировании ингибитор ковалентно связывается с ферментом, необратимо изменяя его нативную конформацию. После удаления ингибитора активность фермента не восстанавливается.

Одним из широко известных типов необратимого ингибирования является действие алкилирующих агентов, образующих прочные ковалентные связи с –SH- группами фермента. Необратимыми ингибиторами также являются цианиды, подавляющие активность ферментов цитохромов, содержащих железо; этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), подавляющий действие α-амилазы, за счёт связывания с ионамиCa⁺²(кофактораα-амилазы).

При обратимом ингибировании активность фермента восстанавливается после удаления ингибитора. Обратимые ингибиторы бывают конкурентного, неконкурентного, бесконкурентного и смешанного действия.

Первая группа – это близкие аналоги субстратов, содержащие весь набор или, по крайней мере, большую часть групп, узнаваемых активным центром фермента, и поэтому образующие комплекс фермент-ингибитор, сходный с комплексом фермент-субстрат. Однако в силу специфики своей структуры они не подвергаются ферментативному превращению. Занимая активный центр, эти ингибиторы препятствуют связыванию субстрата и тем самым протеканию ферментативной реакции. Они фактически конкурируют с субстратом за взаимодействие с активным центром и поэтому их называют конкурентными ингибиторами. Например, структурные аналоги янтарной кислоты – щавелевая, малоновая, щавелево-уксусная – являются конкурентными ингибиторами фермента сукцинатдегидрогеназы, катализирующей окисление янтарной кислоты в фумаровую: