Файл: ОТЧЕТ по НАУЧНОЙ РАБОТЕ.docx

Ниже представлена суммарная реакция, катализируемая глицеральдегид-3 -фосфат-дегидрогеназой:

D-Глицералъдегид-З-фосфат + НАД⁺ + ФН → 1,3-дифосфоглицерат + НАДН + Н⁺

В этой реакции к окислителю НАД⁺ присоединяется электрон от альдегидной группы D-глицеральдегид-З-фосфата. Известно, что кофермент НАД является компонентом козимазы. Он служит переносчиком электронов от D-глицеральдегид-3-фосфата, играющего роль донора электронов, к пирувату, образующемуся на одном из более поздних этапов брожения.

Следовательно, окисление за счет НАД⁺ представляет собой экзергонический процесс, который в обычных условиях идет в сторону завершения, тогда как эндергоническая реакция образования 1,3-дифосфатглицерата в таких условиях идти не может. В суммарной ферментативной реакции эндергонический процесс сопряжен с экзергоническим: энергия, высвобождающая при окислении альдегида, запасается в высокоэнергетической фосфатной группе 1,3-дифосфоглицерата.

Образовавшийся 1,3-дифосфоглицерат вступает далее в ферментативную реакцию с АДФ, катализируемую фосфоглицераткиназой. При этом фосфатная группа переносится на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфоглицерата:

1,3-Дифосфоглицерат + АДФ → 3-Фосфоглицерат + АТФ

Реакция эта сильно экзергоническая, позволяющая предыдущей реакции идти до полного завершения.

Последующее превращение 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат осуществляется посредством фермента фосфоглицеромутазы. Фосфатная группа переносится из положения 3 в глицериновой кислоте в положение 2:

3-Фосфоглицерат → 2-фосфоглицерат

Фермент фосфоглицеромутаза существует в двух формах: 1) для одной из них в качестве промежуточного продукта необходим 2,3-дифосфоглицерат, 2) «собственно» фосфоглюкомутаза, механизм действия которой является аналогом для первой.

При дегидратация 2-фосфоглицерата с образованием фосфоенолпирувата, во второй реакции спиртового брожения образуется высокоэнергетическая связь; реакция катализируется енолазой:

2-фосфоглицерат → Фосфоенолпируват + Н₂О

Рассматриваемая реакция формально представляет собой отщепление молекулы Н₂О от 2-го и 3-го углеродных атомов 2-фосфоглицерата, одновременно ее можно также рассматривать как внутримолекулярный окислительно-восстановительный процесс; так, при отщеплении молекулы Н₂О степень окисления 2-го углеродного атома увеличивается, а 3-го уменьшается. Гидролитическое отщепление фосфатной группы от исходного вещества (2-фосфоглицерата) и от продукта (фосфоенолпирувата) сопровождается совершенно различным изменением стандартной свободной энергии; для фосфоглицерата оно равно приблизительно – 17,6 кДж, а для фосфоенолпирувата – 62,16 кДж. Тем самым дегидратация молекулы 2-фосфоглицерата, в результате которой образуется фосфоенолпируват, сопровождается значительным перераспределением энергии внутри молекулы.

Следующая реакция переноса фосфатной группы от фосфоенолпирувата на АДФ с образованием пирувата и АТФ катализируется пируваткиназой:

Фосфоенолпируват + АДФ → Пируват + АТФ

При декарбоксилирования пирувата образуется ацетальдегид:

Пируват → Ацеталъдегид + СО₂

Катализирует эту реакцию пируватдекарбоксилаза, причем она характеризуется полной необратимостью. Фермент требует наличия ионов Mg²⁺ и кофермента тиаминпирофосфата (ТПФ, или кокарбоксилаза), который представляет собой эфир пирофосфорной кислоты и тиамина, необходимого многим микроорганизмам в качестве фактора роста и в качестве витамина В₁.

Заключительная реакция спиртового брожения обеспечивает восстановление ацетальдегида до этанола под действием фермента алкогольдегидрогеназы. В качестве восстановителя здесь выступает НАДН+Н⁺:

Ацеталъдегид + НАДН +Н⁺ → Этанол + НАД⁺

Суммарное уравнение спиртового брожения можно поэтому написать в следующем развернутом виде:

Глюкоза + 2АТФ + 2НАД⁺ + 2ФН+ 4АДФ + 2НАДН + 2Н⁺ → 2-Этанол + 2 АДФ + 2НАДН + 2Н⁺ + 2НАД + 4АТФ + 2Н₂О

Таким образом, процесс спиртового брожения состоит в превращении одной молекулы D-глюкозы в две молекулы этанола и двух молекул АДФ в две молекулы АТФ; кроме того, от глицеральдегид-3-фосфата к пирувату переносится четыре электрона в форме 2НАДН+2Н⁺. Реакции, обеспечивающие выделение энергии, сохраняют ее в форме АТФ. Причем, спиртовое брожение осуществляется с помощью 12 ферментов, катализирующих этот процесс.

2 Современные способы интенсификации процесса получения этилового спирта

3 Цель и задачи исследования

Интенсификация процесса получения пищевого этилового спирта –проблема, над которой работают специалисты и ученые. В настоящее время разработан ряд технологических методов и приемов, позволяющих в значительной степени сократить сроки брожения, увеличить выход спирта, улучшить его органолептические и технологические параметры. Однако единой технологии, за счет которой был бы достигнут максимальный эффект, до сих пор нет. Каждое производство стремится с наименьшими затратами обеспечить наилучший результат.

В нашей научной работе проводятся исследования, направленные на изучение многофункциональности действия ультразвука на засевные дрожжи в производстве спирта.

Цель работы – разработка способа интенсификации дрожжегенерирования и брожения с использованием засевных дрожжей, активированных ультразвуком.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать влияние ультразвуковой обработки суспензии дрожжей на выживаемость дрожжевых клеток;

- изучить влияние ультразвука на морфологические признаки и физиологическое состояние дрожжей;

- исследовать возможность получения дрожжевого экстракта дезинтеграцией клеток дрожжей ультразвуком;

- подобрать дозу внесения дрожжевого экстракта для активации засевных дрожжей;

- разработать способ обработки спиртовых дрожжей на стадии дрожжегенерирования с использованием многофункциональности действия ультразвука;

- изучить показатели зрелой бражки, полученной при применении активированными ультразвуком и дрожжевым экстрактом дрожжей.

4 Экспериментальная часть

5 Материалы и методы исследования

5.1 Материалы исследований

Для исследования применяли следующее сырье:

– рожь (ГОСТ 16990-88) .

Ферментные препараты:

разжижающий – Термамил СЦ – ТУ 6856-123-64958144-2004;

осахаривающий – Глюкаваморин Г20Х – ТУ 9291-016-00479563-2001.

Вода – СТБ 1188-99.

В качестве сбраживающего материала использовали дрожжи расы 12, ЦД и КМ. Разводку дрожжей и спиртовое сусло готовили в лабораторных условиях.

5.2 Методы исследований

Определение видимой концентрации сухих веществ бражки (ГОСТ 12787-81) [19]

Видимую концентрацию сухих веществ определяют в фильтрате бражки сахаромером или рефрактометром.

Определение действительной концентрации сухих веществ ГОСТ 12787-81) [19]

Для определения действительной концентрации сухих веществ определенный объем фильтрата бражки (100 см³), отмеренный мерной колбой после перегонки переводят в цилиндр и доводят дистиллированной водой до объема 100 см³, перемешивают и при 20ºС определяют действительную концентрацию сухих веществ сахаромером или рефрактомеротром.

Определение концентрации спирта (ГОСТ12787-81) [19]

Концентрацию спирта в бражке определяют в дистилляте, полученном после отгонки его из бражки. Для отгонки в круглодонную колбу вместимостью 250-300 см³ наливают 100 см³ фильтрата бражки, предварительно нейтрализованной 1 моль/дм³ раствором NаОН. Колбу, которой отмеривали бражку, ополаскивают 50 см³ дистилированной воды, присоединяя ополоски к объему. Колбу закрывают пробкой и соединяют с прямоточным холодильником. Соединения должны быть плотными и не пропускать вводно-спиртовых паров.

Дистиллят собирают в мерную колбу вместимостью 100 см³ с предварительно налитыми в нее 15-20 см³ дистилированной воды.

100 см³ дистиллята вливают в стеклянный цилиндр, добавляют 100 см³ воды, перемешивают и при 20ºС ареометром измеряют содержание спирта.

Определение исследование содержания аминного азота [20]

В основу метода положена способность аминокислот образовывать растворимые соединения с медью, количество которой определяют йодометрическим титрованием. Сущность метода заключается в том, что к слабощелочному раствору аминокислот прибавляют избыток суспензии ортофосфата меди в обратном буферном растворе.

Для определения образовавшихся при этом растворимых медных соединений от нерастворимого ортофосфата меди смесь фильтруют. Затем к фильтрату прибавляют уксусную кислоту, которая отщепляет медь от комплексного соединения и превращается в ацетат меди.

Для определения количества меди, участвующей в реакциях, к раствору добавляют йодит калия:

2Cu(CH₃COOO)₂+4KJ=J₂+2CuJ+4CH₃COOK

В результате реакции выделяется йод в количестве. Эквивалентном количеству меди, а следовательно, и азоту аминокислот, который оттитровывают раствором тиосильфата натрия:

J₂+2Na₂S₂O₃=2NaJ+Na₂S₄O₆

1 см³ 0,01 моль/дм³ раствор тиосульфата натрия соответствует 0,28 мг аминного азота, так как один атом меди реагирует с двумя молекулами аминокислот, образуя соединения типа Cu(RCHNH₂COO)₂.

Для проведения опыта в мерную колбу на 50 см³ пипеткой вносят 5-10 см³ исследуемого раствора, добавляют 3-4 капли тимолфталеина и по каплям 1 моль/дм³ раствор гидроксида натрия до появления бледно-голубой окраски. К слабощелочному раствору из цилиндра при помешивании приливают 30 см³ суспензии фосфата меди, содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через плотный фильтр. Фильтрат должен быть совершенно прозрачным.

10 см³ фильтрата пипеткой переносят в коническую колбу, добавляют 0,5 см³ уксусной кислоты и 10 см³ раствора йодита калия. После .перемешивания выделившийся йод титруют из микробюретки 0,01 моль/дм³ раствором тиосульфата натрия, прибавляя в конце титрования 1-2 капли раствора крахмала. Конец титрования определяют по исчезновению синей окраски.

При принятом разбавлении количество аминного азота рассчитывают по уравнению:

Х = а* 0,28 * 100 /2,

где а - количество 0,01 моль/дм³ раствор тиосульфата натрия, пошедшее на титрование, см³.

Колориметрическое определение общего количества растворимых несброженных углеводов [20]

Метод основан на расщеплении сложных углеводов до моносахаров в сильнокислой среде с последующей их дегидратацией и образованием оксиметилфурфурола, который, вступая в реакцию с антроном, образует комплексное соединение синевато-зеленого цвета.

Отобранную пробу бражки фильтруют сначала через полотняный фильтр, затем через бумажный. Первые 20 см³ фильтрата отбрасывают, а последующие используют для анализа. Фильтрат разбавляют дистиллированной водой с таким расчетом, чтобы в разбавленном растворе содержалось от 4 до 10 мг/100 см³ углеводов, т.е. примерно в 50-100 раз. В разбавленном растворе определяют содержание углеводов.