Файл: ОТЧЕТ по НАУЧНОЙ РАБОТЕ.docx

1.2 Биохимические процессы, протекающие при сбраживании спиртового сусла

Спирт образуется в результате сбраживания сахаров дрожжевыми клетками под действием ферментов. Под брожением следует понимать такие энергетические процессы, в которых органические углеродсодержащие соединения функционируют одновременно и как доноры, и как акцепторы электронов. При брожении роль конечного окислителя, или акцептора электронов, играет обычно какая-нибудь органическая молекула, которая образуется в ходе самого брожения.

Брожение – это внутренний окислительно-восстановительный процесс, называемый также анаэробным дыханием в отличие от аэробного дыхания, когда конечным акцептором электрона является кислород.

Из смеси сахаров, содержащейся в сусле, быстрее всех сбраживаются фруктоза и глюкоза. Ди- и трисахариды сусла, которые непосредственно не сбраживаются дрожжами, должны предварительно подвергнуться гидролизу соответствующими ферментами дрожжевых клеток. Из дисахаридов наиболее легко и быстро сбраживается сахароза, которая гидролизуется (инвертируется) уже в начале брожения. Возможно, это объясняется тем, что фермент инвертаза (сахараза) локализована в поверхностном слое дрожжевой клетки. При переходе дрожжей от анаэробных условий к аэробным ослабляется способность их сбраживать глюкозу и мальтозу, а сахаразная активность повышается в 2,5 раза. Мальтозу дрожжи начинают потреблять только тогда, когда фруктозы и глюкозы в сусле почти не остается. Трисахарид рафинозу, сбраживают полностью или на одну треть, это зависит от расы дрожжей.

Для сбраживания сусла в него вводят определенное количество заранее размно­женных дрожжей. Дрожжевая масса, вводимая в сусло, состоит из большого числа отдельных клеток. Несмотря на незначитель­ную величину дрожжевой клетки, общая поверхность дрожжевой массы очень большая, так как только в 1 г прессованных дрож­жей находится примерно 14 млрд. клеток. При эквивалентном среднем диаметре клетки 8 мкм площадь ее поверхности будет равна 5 ·10^-5мм². В соответствии с этим 10 г отпрессованных сухих дрожжей с 25 % сухих веществ имеют поверхность площадью от 9 до 10 м² . При такой сильно развитой поверхности адсорбция составных веществ сусла происходит довольно быстро.

Брожение всегда включает промежуточные окислительно-восстановительные реакции, но никогда не приводит к полному окислению органических веществ. При спиртовом брожении распад сахаров заканчивается образованием этилового спирта и диоксида углерода. Следует также отметить, что одновременно осуществляются и биосинтетические реакции различных побочных продуктов, составляющих примеси этилового спирта.

Основное значение брожения состоит в перестройке структуры молекул гексозы или другого углеродсодержащего соединения. Эти перестройки обусловливают биохимические превращения исходного субстрата, протекание окислительно-восстановительных процессов и образование в конечном итоге высокоактивного и лабильного в химическом отношении метаболита, которым является пировиноградная кислота.

Спиртовое брожение осуществляется ферментативным путем, при котором не участвует кислород. Однако брожение включает в себя окислительно-восстановительные реакции. Об этом особенно отчетливо свидетельствуют конечные продукты спиртового брожения: этанол можно рассматривать как относительно восстановительное соединение, поскольку его молекула содержит определенное количество водорода, а С0₂ – как относительно окислительное, поскольку в его молекуле водород отсутствует.

1.2.1 Химизм спиртового брожения

Процессы спиртового брожения сопровождаются образованием АТФ из АДФ и фосфата. Схема спиртового брожения показана на рисунке 1.

Без одновременного фосфорилирования АДФ они вообще не могут протекать. Суммарное уравнение спиртового брожения имеет следующий вид:

С₆Н₁₂О₆ + 2ФН + 2АДФ = 2СН₃СН₂ОН + 2СО₃ + 2АТФ + 2Н₂О,

причем оно включает ряд стадий спиртового брожения.

На первом этапе различные гексозы вовлекаются в процесс диссимиляции, фосфорилируясь за счет АТФ и образуя общий продукт — глицеральдегид-3-фосфат. Второй этап представляет собой процесс, общий для всех сахаров. Он включает и окислительно-восстановительные реакции, и механизмы накопления энергии – стадии, в ходе которых АДФ фосфорилируется до АТФ.

Первая стадия спиртового брожения начинается с фосфорилирования D-глюкозы за счет АТФ:

Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ

Реакция фосфорилирования как бы запускает процесс брожения. Нейтральная молекула D-глюкозы при этом активируется для участия в последующих этапах диссимиляции. В результате фосфорилирования за счет АТФ глюкоза превращается в отрицательно заряженную частицу – глюкозо-6-фосфат. Этот процесс катализируется ферментами двух типов: гексокиназой и глюкокиназой, которые различаются между собой по специфичности действия в отношении сахаров. Превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат происходит в результате реакции изомеризации.

Данный процесс катализирует фермент фосфоглюкоизомераза. При фосфорилировании D-фруктозо-6-фосфата с образованием фруктозо-1,6-дифосфата используется еще одна молекула АТФ при участии фермента фосфофруктокиназы.

Фруктозо-6-фосфат + АТФ → Фруктозо-1,6-дифосфат

Роль специфического акцептора фосфата в реакции играет фруктозо-6-фосфат. Роль донора фосфата могут выполнять помимо АТФ также УТФ и ИТФ (уридинтрифосфат и инозинтрифосфат).

Фосфорилирование фруктозо-6-фосфата – важный этап, при помощи которого осуществляется регуляция брожения. Фосфофруктокиназа относится к числу аллостерических, или регуляторных, ферментов. Поскольку фосфофруктокиназа ингибируется АТФ и цитратом (в высоких концентрациях) и стимулируется АДФ и АМФ, считается, что она представляет собой поливалентный аллостерический фермент, т. е. подчиняется действию более чем одного специфического модулятора (метаболита-ингибитора).

Фосфофруктокиназа, как регуляторный фермент, катализирует реакцию, лимитирующую общую скорость спиртового брожения.

Расщепление фруктозе-1,6-дифосфата на глицеральдегид-3-фосфат и диоксиацетонфосфат осуществляется альдолазой. Реакция представляет собой обратимую альдольную конденсацию:

D-Фруктозо-1,6-дифосфат→Диоксиацетонфосфат+D-Глицеральдегид-З-фосфат

Свободная энергия в этой реакции выражается довольно большой положительной величиной. В реакциях этого типа, в которых одна молекула исходного вещества расщепляется с образованием двух молекул продукта, на положение равновесия сильно влияет концентрация исходного вещества. Чем меньше начальная концентрация фруктозо-1,6-дифосфата, тем большая доля его должна расщепляться для того, чтобы было достигнуто состояние равновесия.

Глюкоза

АТФ; Мg²⁺

Гексокиназа

Глюкозо-6-фосфат + АДФ – ~Р

Глюкозофосфатизомераза

Фруктазо-6-фосфат

Фосфофруктокиназа

Фруктозо-1,6-дифосфат + АДФ – ~Р Глицерин

Альдолаза

(Zn²⁺,Co²⁺,Ca²⁺)

Фосфодиоксиацетон Изомераза 3-Фосфоглицериновый

альдегид

Н₃РО₄

неорганическя

1,3-Дифосфоглицериновая кислота

Триозофосфадегидрогеназа

2НАД 2НАД Н₂

1,3-Дифосфоглицериновая кислота

АДФ Фосфотрансфераза

АТФ

3-Фосфоглицериновая кислота

Фосфоглицератмутаза

2-Фосфоглицериновая кислота

Н₂О Энолаза

Mg²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺

Фосфоэнолпировиноградная кислота

АДФ Фосфотрансфераза

АТФ К⁺

Энолпировиноградная кислота

Пировиноградная кислоа

Карбоксилаза

Уксусный альдегид + СО²

Алкогольдегидрогеназа

Этиловый спирт

Рисунок 1 – Схема спиртового брожения

Молекула альдолазы (молекулярная масса 150000) состоит из четырех субъединиц. В кислой среде фермент диссоциирует на неактивные субъединицы; в нейтральной среде субъединицы легко и самопроизвольно воссоединяются, образуя активный фермент. Альдолаза содержит свободные SH-группы; некоторые из них играют важную роль в ее каталитической активности. Фермент проявляет строгую специфичность в отношении диоксиацетонфосфата, но вместо глицеральдегид-3-фосфата может катализировать реакцию с другими альдегидами, например с ацетальдегидом или незамещенным глицериновым альдегидом.

Полагают, что альдолаза образует фермент-субстратный комплекс с диоксиацетонфосфатом и другими кетозо-1-фосфатами.

Таким образом, перечисленная цепь реакций завершают первую стадию спиртового брожения, в которой молекула углевода путем двух фосфорилирований и расщепления подготавливается для второй стадии.

На второй стадии протекают окислительно-восстановительные реакции и реакции фосфорилирования, в процессе которых генерируется АТФ. Поскольку из одной молекулы глюкозы образуются 2 молекулы глицеральдегид-3-фосфата, в последующих реакциях обе половины молекулы глюкозы претерпевают одинаковые превращения.

При окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата энергия, освобождающаяся при окислении альдегидной группы глицеральдегид-3-фосфата, сохраняется в форме высокоэнергетического продукта окисления 1,3-дифосфоглицерата.

В этой реакции проявляется одновременно ферментативный и химический механизм, с помощью которого энергия, высвобождающаяся в ходе окисления органических молекул, может запасаться в молекулах АТФ. Катализирует эту реакцию глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа. Фермент получен в кристаллическом виде (молекулярная масса 140 000) из дрожжей и мышц животных. Молекула его содержит 4 идентичные субъединицы, каждая из которых представляет собой одиночную полипептидную цепь, состоящую примерно из 330 аминокислотных остатков.