Файл: Практикум по генетике.pdf

8.После внесения образцов подключить электрический ток и провести электрофорез.

9.После проведения электрофореза выложить гель на трансиллюминатор и детектировать результат.

5.9 Рестрикция

Рестриктазы – бактериальные ферменты, которые узнают определенную последовательность нуклеотидов на молекуле ДНК («сайт рестрикции») и разрезают ДНК внутри этой последовательности (рис. 5.20). Рестрикцию фрагментов ДНК проводят в пробирке в специальном солевом буфере, специфичном для каждой рестриктазы.

Рис. 5.20. Рестриктазы расщепляют фосфодиэфирные связи между нуклеотидами

Ферменты рестрикции были обнаружены у микроорганизмов, где они в составе системы рестрикции-модификации (Р-М системы)

выполняют защитную роль – разрушают чужеродную ДНК, попадающую в клетку. В бактериальную Р-М систему входят два специфичных для каждого штамма типа фермента – метилазы, модифицирующие ДНК в сайтах рестрикции и расщепляющие ДНК в определенных сайтах

219

рестрикции (эндонуклеаза рестрикции - рестриктаза). С помощью специальных метилаз, собственная клеточная ДНК модифицируется так,

что рестриктазы оказываются неспособны разрезать ее в специфических сайтах рестрикции. Однако, любая чужеродная ДНК, вторгающаяся в клетку, оказывается чувствительна к действию рестриктаз.

К настоящему моменту известно более 3000 рестриктаз, «узнающих» около 200 различных сайтов рестрикции. Рестриктазы

«узнающие» одни и те же сайты рестрикции называют изошизомеры.

Уникальные сайты рестрикции характеризуются большим разнообразием первичной структуры. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющихся палиндромами - обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК). Например:

Alu I : 5'-AGCT-3'

3'-TCGA-5'

Bam HI 5’ GGATTC 3’

3’ CCTAAG 5’

Sbf I 5'-CCTGCAGG-3'

3'-GGACGTCC-5'

При работе с чистыми препаратами рестриктаз необходимо соблюдать осторожность, поскольку, как и многие другие ферменты они теряют активность при комнатной температуре, поэтому их необходимо хранить в морозильнике, при температуре не выше -180С, а

транспортировать и использовать в лабораторных условиях только во льду.

Однако, даже при соблюдении всех мер предосторожности срок жизни

(сохранение активности и специфичности гидролиза) большинства

220

ферментов не превышает одного года. Поэтому использовать их после истечения гарантийного срока, указываемого производителем на упаковке,

не рекомендуется. Необходимо помнить, что в разбавленном виде большинство ферментов чрезвычайно плохо хранятся и сохраняют свою активность на протяжении короткого периода времени.

Протокол рестрикции продуктов ПЦР

1. Смешать в пробирке следующие компоненты:

- продукт ПЦР_________________________________ 8 мкл

-буфер для рестрикции (10 Х)____________________ 1,5 мкл

-дистиллированная вода _________________________5,5 мкл

2.Перемешать компоненты и добавить 5 ед. рестриктазы (0,5 мкл).

3.Покрыть смесь минеральным маслом, чтобы предотвратить испарение

4.Пипетировать смесь и инкубировать пробирку в термостате на 650С в

течение 4 часов.

5.Провести электрофорез продуктов рестрикции для чего добавить к смеси для рестрикции 3 мкл красителя для электрофореза и внести образцы в гель.

221

РАЗДЕЛ 6

ИЗМЕНЧИВОСТЬ

Изменчивость – свойство всех живых организмов, заключающееся в способности организмов изменяться под воздействием наследственных и ненаследственных факторов. Изменчивость определяет различия между признаками у особей одного вида, а также между родственными особями одного или нескольких поколений, между родительскими особями и потомками. Типы изменчивости можно представить схематически следующим образом:

Изменчивость

Комбинационная Мутационная

Онтогенетическая

Изменчивость может быть наследственной – мутационной,

комбинативной, онтогенетической и ненаследственной –

модификационной.

Наследственная изменчивость – способность генетического материала претерпевать изменения, наследуемые в потомстве.

Ненаследственная изменчивость – изменение признаков и свойств,

которые у особей или определенных групп особей вызываются воздействием внешних факторов. Такие ненаследственные признаки в их

222

конкретном проявлении у каждой особи не передаются по наследству и развиваются у особей последующих поколений лишь при наличии условий, в которых они возникли.

Комбинативная изменчивость – является результатом перекомбинации генов, хромосом и их сегментов, что приводит к новым комбинациям аллелей у потомков, по сравнению с родителями в результате случайного сочетания при оплодотворении и вследствие кроссинговера.

Онтогенетическая изменчивость – совокупность последовательных изменений признаков и свойств особи в процессе ее индивидуального развития. В онтогенезе особи происходит реализация наследственной информации, полученной от родителей, путем последовательного совместного действия комплекса генов при действии разнообразных факторов среды

6.1. Модификационная изменчивость

Модификационная изменчивость – варьирование проявления признака у генотипически однородных форм под влиянием разнообразных условий среды.

Пределы модификационной изменчивости контролируются генотипом. Признак может варьировать в узких или в широких пределах.

Пределы реакции определенного организма на изменчивость внешних условий получили название норма реакции генотипа.

Для сельскохозяйственной практики наибольшую ценность представляют генотипы с широкой нормой реакции, что обеспечивает широкую приспособительную реакцию к постоянно меняющимся условиям.

Модификационные изменения:

1. адекватны, т.е. соответствуют условиям, их вызывающим;

223

2.адаптивны, т.е. модификационное изменение обусловливает приспособление к условиям его вызывающим;

3.имеют массовый характер: одно и то же воздействие вызывает одинаковую и вполне определенную изменчивость у всех генотипически сходных особей;

4.степень выраженности модификационных изменений определяется силой и продолжительностью действия на организм вызывающего данные модификации фактора среды.

Существенным компонентом вариабельности выраженности признака является стадия онтогенеза (отногенетическая изменчивость).

Каждый организм обладает индивидуальной изменчивостью.

Изменчивость может быть двух типов: количественная (определяется метрическими мерами: вес, масса, рост и т.п.) и качественная (окраска,

форма семян и т.п., как правило, не может быть определена метрическими мерами).

Для изучения степени и характера модификационной изменчивости используют статистический анализ.

Модификационную изменчивость изучают на основании анализа проявления признака у группы особей. Вся группа растений или животных, у которых данный признак изучают, называется генеральной совокупностью (N). На практике изменчивость признака изучают не у всех особей генеральной совокупности, а у части их – выборочной совокупности (n).

Основными показателями, характеризующими степень изменчивости данного признака, являются: дисперсия ( 2 ), стандартное отклонение ( )

и коэффициент вариации (V).

Показателем, характеризующим проявление признака у растений данной выборки, является средняя арифметическая ( x ). Учитывая, что анализируют не генеральную совокупность, а только часть ее (выборочную совокупность) необходимо определить показатель ошибки вычисленных

224

параметров – ошибку средней арифметической ( sx ), ошибку среднего квадратического отклонения ( s ), ошибку коэффициента вариации ( sV ).

Средняя арифметическая ( x ) характеризует среднюю величину признака выборочной совокупности изучаемых растений. Среднюю арифметическую вычисляют по формуле:

x x n

Дисперсия ( 2 ) и стандартное отклонение ( ) служат основными мерами вариации признака и вычисляются по формулам:

2 x x 2 n 1

Коэффициент вариации (V) используют для сравнения изменчивости разных признаков у растений одной выборки или изменчивости одного признака у разных сортов, или оценки степени выравненности изучаемого материала. Коэффициент вариации вычисляют по формуле:

V 100% x

Условно принято, что коэффициент вариации меньше 10%

свидетельствует об относительно слабой изменчивости признака, 10-20% –

средней и более 20% – сильной изменчивости.

Ошибка выборочной средней ( sx ) показывает теоретические пределы соответствия средней арифметической выборочной и генеральной совокупности. Ошибку выборочной средней вычисляют по формуле:

225