Файл: Учебнометодическое пособие Физиология возбудимых систем Часть 1 Казань 2012 удк 612. 813.pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 12.01.2024
Просмотров: 156
Скачиваний: 1
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Как видно из приведенной формулы, скорость диффузии dm/dt прямо пропорциональна площади поверхности, через которую происходит диффузия, концентрационному градиенту и обратно пропорциональна расстоянию.
Для определения скорости проникновения вещества в клетку из межклеточного пространства используется формула dm/dt = - PS (c - ct) ,
где P – константа проницаемости; S – площадь поверхности клетки; c – начальная концентрация вещества; ct – концентрация вещества в момент наступления диффузионного равновесия.
Поскольку диффузия представляет собой пассивный процесс, она осуществляется в обоих направлениях, и со временем происходит выравнивание встречных диффузионных потоков. Кроме того, как видно из вышеприведенных формул, скорость диффузии и проникновения вещества в клетку будет снижаться с уменьшением концентрационного градиента во времени. В живых системах, которые характеризуются определенной интенсивностью обмена веществ,
имеют место однонаправленные потоки, базирующиеся на механизмах активного транспорта, осуществляемого против концентрационного градиента. Кроме того, односторонняя проницаемость биологических мембран определяется: а) физико-химической асимметрией, обусловленной многослойностью тканевых мембран,
б) способностью разных слоев в различной степени адсорбировать молекулы растворенных веществ,
в) различным сродством слоев к веществам, имеющим разную pH, г) асимметрией белковых молекул переносчиков в мембране
Классической моделью биологической мембраны, обладающей односторонней проницаемостью, является кожа лягушки. Она состоит из двух слоев: соединительно-тканного и эпителиального.
Эпителиальный слой лучше адсорбирует молекулы таких красителей,
как метиленовый синий, толуидиновый синий, тионин и др.
Адсорбционная способность соединительно-тканного слоя хуже.
Поэтому молекулы красителей группы тиазонов перемещаются в направлении от соединительной ткани к эпителию.
Цель работы: изучить проницаемость кожи лягушки для красителей в зависимости от точки их приложения и влияния различных химических факторов.
Для работы необходимо: физиологический раствор хлорида натрия, 0.1% и 0.01% растворы метиленового синего на
10
физиологическом растворе, набор препаровальных инструментов,
стеклянные трубки различных диаметров с оплавленными концами,
маленькие стеклянные стаканчики, широкие резиновые кольца или лента из тонкой резины, нитки, проволочные рамки, термостат,
фотоэлектроколориметр, лягушка.
Ход работы
1. Приготавливают препарат кожного мешка. Для этого лягушку обездвиживают, делают кольцевые надрезы кожи на уровне головки бедренной кости и снимают “чулком” кожу с задних конечностей. Во избежание подсыхания получившиеся кожные трубки смачивают водой снаружи и физиологическим раствором изнутри. Готовят два варианта кожных мешков: в нормальном положении – эпителием наружу и в вывернутом – эпителием внутрь. Широкой частью натягивают их на стеклянные трубки подходящего диаметра и укрепляют при помощи прочных ниток. С целью проверки герметичности кожные мешки заполняют физиологическим раствором.
2.
Заменить растворы Рингера на равные объемы раствора метиленового синего 0.1% и погрузить цилиндры в стаканчики с 10 мл раствора Рингера. Следить, чтобы уровни раствора красителя в цилиндрах и раствора Рингера в стаканчиках совпадали.
3. Стаканчики с цилиндрами поместить на 1 час в термостат, при температуре 22° С.
4.
По истечении указанного срока препараты кожных мешков удаляют, а содержимое стаканчиков колориметрируют, используя в качестве контрольного раствора 0.01 % раствор метиленового синего.
5. Аналогичные опыты провести с кожей лягушки, предварительно помещенной на 30 мин.: а) в дистиллированную воду или б) в 0.125 М
раствор KCl.
6. Результаты опытов заносят в табл. 1.
Таблица 1
Образец оформления результатов эксперимента
Количеств о прошедшего красителя
Исследуе мый в физиологическ ом растворе после обработки
H
2
O
после обработки KCl после обработки 70° этанолом объект
Нормальн ый мешок
11
стеклянные трубки различных диаметров с оплавленными концами,
маленькие стеклянные стаканчики, широкие резиновые кольца или лента из тонкой резины, нитки, проволочные рамки, термостат,
фотоэлектроколориметр, лягушка.
Ход работы
1. Приготавливают препарат кожного мешка. Для этого лягушку обездвиживают, делают кольцевые надрезы кожи на уровне головки бедренной кости и снимают “чулком” кожу с задних конечностей. Во избежание подсыхания получившиеся кожные трубки смачивают водой снаружи и физиологическим раствором изнутри. Готовят два варианта кожных мешков: в нормальном положении – эпителием наружу и в вывернутом – эпителием внутрь. Широкой частью натягивают их на стеклянные трубки подходящего диаметра и укрепляют при помощи прочных ниток. С целью проверки герметичности кожные мешки заполняют физиологическим раствором.
2.
Заменить растворы Рингера на равные объемы раствора метиленового синего 0.1% и погрузить цилиндры в стаканчики с 10 мл раствора Рингера. Следить, чтобы уровни раствора красителя в цилиндрах и раствора Рингера в стаканчиках совпадали.
3. Стаканчики с цилиндрами поместить на 1 час в термостат, при температуре 22° С.
4.
По истечении указанного срока препараты кожных мешков удаляют, а содержимое стаканчиков колориметрируют, используя в качестве контрольного раствора 0.01 % раствор метиленового синего.
5. Аналогичные опыты провести с кожей лягушки, предварительно помещенной на 30 мин.: а) в дистиллированную воду или б) в 0.125 М
раствор KCl.
6. Результаты опытов заносят в табл. 1.
Таблица 1
Образец оформления результатов эксперимента
Количеств о прошедшего красителя
Исследуе мый в физиологическ ом растворе после обработки
H
2
O
после обработки KCl после обработки 70° этанолом объект
Нормальн ый мешок
11
Вывернут ый мешок
Лабораторная работа № 3 Исследование влияния рН на
проницаемость кожи лягушки.
Цель работы: изучить проницаемость кожи лягушки для красителей в зависимости от рН.
Для работы необходимо: физиологический раствор хлорида натрия, 0.125% раствор нейтрального красного на физиологическом растворе, набор препаровальных инструментов, стеклянные трубки различных диаметров с оплавленными концами, маленькие стеклянные стаканчики, широкие резиновые кольца или лента из тонкой резины,
нитки, проволочные рамки, термостат, фотоэлектроколориметр,
лягушка, буферные растворы по Серенсену.
Ход работы
1. Приготавливают препарат кожного мешка как описано в предыдущей работе. Широкой частью натягивают их на стеклянные трубки подходящего диаметра и укрепляют при помощи прочных ниток. С целью проверки герметичности кожные мешки заполняют физиологическим раствором.
2. Для исследования влияния рН на одностороннюю проницаемость кожи лягушки для основного индикатора готовят буферные растворы по Серенсену. Буферные растворы представляют собой фосфатные смеси, приготовленные путем смешивания в различных пропорциях 1/15М раствора Na
2
HPO
4
и 1/15 M раствора
KH
2
PO
4.
Варьируя соотношение исходных компонентов, получают фосфатные смеси (табл. 2).
Таблица 2
Фосфатная смесь Серенсена.
рН
1/15М Na
2
HPO
4
, мл
1/15 M раствора
KH
2
PO
4.
5,28 0,25 9,75 7,73 9,0 1,0 3.
В качестве основного красителя используется 0.125%
раствор нейтрального красного, который перед заполнением кожных мешков предварительно забуферивают фосфатной смесью из расчета 1
объем буферного раствора на 2 объема раствора индикатора.
12
Физиологический раствор перед заполнением стаканчиков забуферивают в том же соотношении.
4.
Используют следующие сочетания рН буфеных растворов для приготовления наружного раствора и раствора индикатора (табл. 3).
Таблица 3
№
рН фосфатной смеси для наружного раствора рН фосфатной смеси для индикатора
Т,
%
1 5,28 5,28 2
5,28 7,73 3
7,73 5,28 4
7,73 7,73 5. Заменить растворы Рингера на равные объемы раствора нейтрального красного и погрузить цилиндры в стаканчики с 10 мл раствора Рингера. Термостатирование кожных мешков производят 1 час в термостате, при 22° С.
6. Перед колориметрированием содержимое стаканчиков подкисляют одной каплей 2% раствора серной кислоты. В качестве контроля используйте подкисленный 0,01 % раствор нейтрального красного.
Полученные результаты внесите в сводную таблицу 3.
Сделайте выводы.
Контрольные вопросы
1. Что называют раздражимостью и возбудимостью?
2. Какие ткани в физиологии называют возбудимыми, какие- невозбудимыми?
3. Дайте определение понятию "раздражитель".
4.
Каким образом можно экспериментально доказать существование активного транспорта натрия?
5. Что понимают под проницаемостью клеточной мембраны? От чего она завиcит?
6. Что понимают под проводимостью ионов в электрофизиологии?
От чего она зависит?
7. Проницаемость клеточной мембраны для калия или для натрия в состоянии покоя больше?
8. От чего зависит проводимость ионов через клеточную мембрану?
9.
Какой опыт доказывает основную роль ионов калия в
13
обеспечении существования потенциала покоя? Опишите его сущность.
10.
Назовите виды ионного транспорта через клеточную мембрану. Поясните их сущность.
10.
Назовите виды ионного транспорта через клеточную мембрану. Поясните их сущность.
Глава 2 Потенциал покоя
Мембранный потенциал покоя это результат разделения зарядов относительно клеточной мембраны. При этом положительные заряды концентрируется на наружной поверхности мембраны, а
отрицательные заряды - на внутренней поверхности
Мембранно- ионную теорию происхождения мембранного потенциала покоя предложил Юлиус Бернштейн, ученик Дюбуа-Реймона, в начале прошлого века (1902 г). Мембранный потенциал покоя широко колеблется в различных клетках (от -5 до -100 мВ). Наибольшие значения мембранного потенциала покоя зарегистрированы в возбудимых клетках - нервных, мышечных и секреторных, в которых его величина составляет от -60 до -90 мВ.
Формирование мембранного потенциала происходит в результате движения ионов по концентрационному градиенту через каналы,
открывающиеся в покое. Возникновение мембранного потенциала является пассивным процессом, который не требует затрат энергии.
Однако, энергия нужна на этапе создания градиента концентрации для ионов при работе транспортных систем. В различных живых клетках мембранного потенциала покоя формируется по-разному. В глиальных клетках в его формировании принимают участие только ионы K,
которые двигаются через K-каналы утечки.
В большинстве нервных клеток мембранный потенциал возникает при движении ионов K и Na. Очень редко в формировании мембранного потенциала покоя принимают участие и ионы Cl. В
глиальных клетках в состоянии покоя открыты только K-каналы
утечки. В этом случае, ионы K двигаются благодаря химической движущей силе из цитоплазмы в окружающую среду и концентрируются около наружной поверхности мембраны, формируя положительный заряд. Внутри отрицательный заряд формируется вследствие потери клеткой ионов K, за счет внутриклеточных органических анионов, непроникающих через мембрану, и за счет приближения ионов Cl к внутренней поверхности мембраны.
Как только сформировался заряд на мембране, появляется электрическая движущая сила, заставляющая ионы K входить внутрь
14
клетки. В конце концов, устанавливается равновесие этих сил, и ток ионов K через каналы прекращается. Возникающий мембранный потенциал будет соответствовать калиевому равновесному потенциалу
(примерно -80 мВ). K-ток через мембрану можно представить следующим образом: I
K
=g
K
(V
m
-E
K
), где V
m
– мембранный потенциал,
g
K
– проводимость мембраны для ионов K (сумма проводимостей всех открытых K-каналов), E
K
– равновесный потенциал для иона K.
Поскольку в условиях равновесия K-ток равен нулю, то V
m
=E
K
В нервных клетках в состоянии покоя мембрана хорошо проницаема для K и в небольшой степени – для Na, поэтому в формирование мембранного потенциала покоя оказывают вклад ионы
Na. Поскольку на мембране имеется значительный концентрационный градиент для ионов Na и уже существует разность потенциалов,
возникают химическая и электрическая движущие силы направленные внутрь, заставляющие ионы Na входить в клетку, то есть появляется входящий Na-ток через открытые Na-каналы. В результате через мембрану начинают течь два разнонаправленных тока – входящий,
деполяризующий, натриевый
I
Na
=g
Na
(V
m
-E
Na
)
и выходящий,
гиперполяризующий, калиевый I
K
=g
K
(V
m
-E
K
), где g
K и g
Na
- проводимости мембраны для ионов K и Na, E
Na и E
K
– равновесные потенциалы для иона K и Na. В конечном итоге, возникнет равновесие,
когда эти два тока становятся равны и противоположны по направлению I
K
= -
I
Na
. При этом установится новое значение мембранного потенциала покоя (V
m
) на более низком уровне:
V=
g
K
⋅
E
K
+g
Na
⋅
E
Na
g
K
+g
Na
Отсюда, в нервных клетках, по сравнению с глиальными,
мембранный потенциал покоя несколько ниже (примерно, -60 мВ) и меньше калиевого равновесного потенциала.
Роль ионов Cl в формировании мембранного потенциала покоя неоднозначна в различных клетках. В большинстве клеток ионы хлора пассивно распределяются по обе стороны мембраны, токи через Cl- каналы в покое отсутствуют, а имеющийся мембранный потенциал равен потенциалу равновесия для хлора. Если же ионы Cl активно транспортируются из клетки, то появление Cl-тока через потенциал- активируемые Cl-каналы делает мембранный потенциал покоя более негативным:
V
m
=
g
K
⋅
E
K
+g
Na
⋅
E
Na
+g
Cl
⋅
E
Cl
g
K
+g
Na
+g
Cl
Кроме этого, в величину мембранного потенциала покоя вносит свой вклад Na/K насос. Насос является электрогенным, так как при
15
(примерно -80 мВ). K-ток через мембрану можно представить следующим образом: I
K
=g
K
(V
m
-E
K
), где V
m
– мембранный потенциал,
g
K
– проводимость мембраны для ионов K (сумма проводимостей всех открытых K-каналов), E
K
– равновесный потенциал для иона K.
Поскольку в условиях равновесия K-ток равен нулю, то V
m
=E
K
В нервных клетках в состоянии покоя мембрана хорошо проницаема для K и в небольшой степени – для Na, поэтому в формирование мембранного потенциала покоя оказывают вклад ионы
Na. Поскольку на мембране имеется значительный концентрационный градиент для ионов Na и уже существует разность потенциалов,
возникают химическая и электрическая движущие силы направленные внутрь, заставляющие ионы Na входить в клетку, то есть появляется входящий Na-ток через открытые Na-каналы. В результате через мембрану начинают течь два разнонаправленных тока – входящий,
деполяризующий, натриевый
I
Na
=g
Na
(V
m
-E
Na
)
и выходящий,
гиперполяризующий, калиевый I
K
=g
K
(V
m
-E
K
), где g
K и g
Na
- проводимости мембраны для ионов K и Na, E
Na и E
K
– равновесные потенциалы для иона K и Na. В конечном итоге, возникнет равновесие,
когда эти два тока становятся равны и противоположны по направлению I
K
= -
I
Na
. При этом установится новое значение мембранного потенциала покоя (V
m
) на более низком уровне:
V=
g
K
⋅
E
K
+g
Na
⋅
E
Na
g
K
+g
Na
Отсюда, в нервных клетках, по сравнению с глиальными,
мембранный потенциал покоя несколько ниже (примерно, -60 мВ) и меньше калиевого равновесного потенциала.
Роль ионов Cl в формировании мембранного потенциала покоя неоднозначна в различных клетках. В большинстве клеток ионы хлора пассивно распределяются по обе стороны мембраны, токи через Cl- каналы в покое отсутствуют, а имеющийся мембранный потенциал равен потенциалу равновесия для хлора. Если же ионы Cl активно транспортируются из клетки, то появление Cl-тока через потенциал- активируемые Cl-каналы делает мембранный потенциал покоя более негативным:
V
m
=
g
K
⋅
E
K
+g
Na
⋅
E
Na
+g
Cl
⋅
E
Cl
g
K
+g
Na
+g
Cl
Кроме этого, в величину мембранного потенциала покоя вносит свой вклад Na/K насос. Насос является электрогенным, так как при
15
каждом цикле работы насоса три иона Na выводятся из клетки и два иона K поступают в клетку. Клетка постоянно теряет положительные заряды и разность потенциалов на мембране увеличивается на 6-12 мВ.
Итак, мембранный потенциал покоя представляет собой разность потенциалов между наружной и внутренней поверхностью мембраны клетки. Он является результатом разделения зарядов относительно клеточной мембраны, которое возникает за счет движения заряженных ионов по концентрационным градиентам через ионные каналы,
открывающиеся в покое. Наличие потенциала на мембране возбудимой клетки лежит в основе механизмов возникновения в ней электрических распространяющихся сигналов – ПД.
Лабораторная работа № 4 Зависимость величины потенциала
покоя мышцы лягушки от точки приложения электродов к
поперечному разрезу и продольной поверхности.
Цель: определить величину потенциала покоя мышцы и продемонстрировать, что когда используется прибор, работающий по току, изменение сопротивления между отводимыми точками самого объекта существенно меняют показания прибора.
Для работа необходимо: изолированная икроножная мышца лягушки, гальванометр, препаровальный набор, фильтровальная бумага.
Ход эксперимента: На свежем препарате икроножная мышца лягушки производят поперечный разрез мышечных волокон и измеряют потенциал покоя мышцы при расположении первого электрода в центре поперечного разреза, второго - на поверхности у края разреза. Далее электрод поверхности отодвигают от разреза на 2
мм и вновь измеряют потенциал покоя, еще раз отодвигают на 2 мм и вновь замеряют потенциал покоя и так до тех пор, пока два последних замера не дадут одинаковый результат (15-20 мм).
Установив электрод поверхности в точке наибольшего потенциала,
а электрод разреза — в центре последнего вновь определяют потенциал покоя. Затем электрод разреза перемещают к краю шагом по 2 мм. Все измерения производятся как можно быстрее, одно за другим.
Оформление результатов Полученные результаты фиксируются в протоколе. По ним следует построить два графика: график зависимости потенциала покоя от перемещения электрода поверхности, и график изменения потенциал покоя при перемещении электрода разреза.
16
Итак, мембранный потенциал покоя представляет собой разность потенциалов между наружной и внутренней поверхностью мембраны клетки. Он является результатом разделения зарядов относительно клеточной мембраны, которое возникает за счет движения заряженных ионов по концентрационным градиентам через ионные каналы,
открывающиеся в покое. Наличие потенциала на мембране возбудимой клетки лежит в основе механизмов возникновения в ней электрических распространяющихся сигналов – ПД.
Лабораторная работа № 4 Зависимость величины потенциала
покоя мышцы лягушки от точки приложения электродов к
поперечному разрезу и продольной поверхности.
Цель: определить величину потенциала покоя мышцы и продемонстрировать, что когда используется прибор, работающий по току, изменение сопротивления между отводимыми точками самого объекта существенно меняют показания прибора.
Для работа необходимо: изолированная икроножная мышца лягушки, гальванометр, препаровальный набор, фильтровальная бумага.
Ход эксперимента: На свежем препарате икроножная мышца лягушки производят поперечный разрез мышечных волокон и измеряют потенциал покоя мышцы при расположении первого электрода в центре поперечного разреза, второго - на поверхности у края разреза. Далее электрод поверхности отодвигают от разреза на 2
мм и вновь измеряют потенциал покоя, еще раз отодвигают на 2 мм и вновь замеряют потенциал покоя и так до тех пор, пока два последних замера не дадут одинаковый результат (15-20 мм).
Установив электрод поверхности в точке наибольшего потенциала,
а электрод разреза — в центре последнего вновь определяют потенциал покоя. Затем электрод разреза перемещают к краю шагом по 2 мм. Все измерения производятся как можно быстрее, одно за другим.
Оформление результатов Полученные результаты фиксируются в протоколе. По ним следует построить два графика: график зависимости потенциала покоя от перемещения электрода поверхности, и график изменения потенциал покоя при перемещении электрода разреза.
16