Коллоквиум по вирусологии №2.

Вопрос № 1.

Культивирование вирусов на куриных эмбрионах.

Преимущество куриных эмбрионов:

1. 
   Высокая чувствительность к широкому спектру вирусов (не образуются антитела в ответ на заражение);
   
2. 
   Легкодоступный объект (птицефабрики и инкубаторы);
   
3. 
   Стерильность – скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрионы от бактериального и грибкового заражения со стороны внешней среды;
   
4. 
   Экономичны (не требуют ухода и кормления);
   

Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам:

1. 
   Куриные эмбрионы должны быть получены из благоприятных по инфекционным заболеваниям хозяйств;
   
2. 
   Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя);
   
3. 
   Возраст эмбриона должен соответствовать выбранному методу заражения;
   
4. 
   Куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами с 5-го по 12-ый день инкубации;
   

Заражение:

1. 
   В желточный мешок – с 5-го по 7-й день инкубации;
   
2. 
   В амниотическую полость – с 6-го по 1-ый день;
   
3. 
   В аллантоисную – на 9-11-ый день;
   
4. 
   На хорионаллантоисную оболочку – на 10-12-ый день;
   

Содержание куриных эмбрионов в лабораторных условиях:

1. 
   Куриные эмбрионы содержат в термостате при температуре 37°С и влажности 60-70%;
   
2. 
   Качество яйца оценивается по: размеру, состоянию скорлупы, форме;
   
3. 
   Скорлупная оболочка должна быть гладкой, матового тона, целостной;
   
4. 
   Яйца с темными пятнами не допускаются к исследованию (бактерии или плесневые грибы);
   

Подготовка куриных эмбрионов к заражению:

1. 
   Подготовка рабочего места, дезинфекция скорлупы, овоскопирование (просмотр яиц против яркого источника света);
   
2. 
   На скорлупной оболочке карандашом отмечают 3 участка: границу воздушной камеры, место расположения зародыша и бессосудистые зоны размером 0,5 на 0,5 см;
   
3. 
   Определяют погиб или жив зародыш;
   

Заражение в аллантоисную полость:

Вирусы гриппа, ньюкалской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и тд.

В скорлупе на стороне зародыша делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу с вирус содержащим материалом вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным стерильным парафином.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку:

Вирусы оспы, чумы плотоядных, катаральной лихорадки овец и др. (пантропные и дерматропные вирусы).

---

В скорлупе против центра воздушной камеры вырезают отверстие диаметром 15-20 мм. Пинцетом снимают подскорлупную оболочку, на обнажившийся участок ХАО вводят 0,2 мм вирус содержащей суспензии, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином.

Заражение в желточный мешок:

Вирусы катаральной лихорадки овец, хламидий, ринопневмонии лошадей и др.

Игла вводится на глубину 3,5-4 см под углом 45°.

Признаки размножения вируса в курином эмбрионе:

1. 
   Индикация вирусов (индикацию вирусов в курином эмбрионе осуществляют на основании специфических поражений в различных структурах эмбриона, а также в РГА. Кроме того, в характерные для данного вируса сроки может наблюдаться гибель эмбриона);
   
2. 
   Изменение тела зародыша:
   

• 
  Зародыш может отставать в росте и развитии от незараженных;
  
• 
  Тело его может быть обезвожено, шея характерно перекручена (инфекционный бронхит кур);
  
• 
  Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями;
  
• 
  Внутренние органы также могут быть изменены (например, увеличенная желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень – признак размножения в ней вируса гепатита утят);
  

3. 
   Существуют вирусы, которые, размножаясь в эмбрионах не вызывают ни патологоанатомических изменений, ни гибели. Выявить такой вирус можно с помощью реакции гемагглютинации (РГА);
   
4. 
   Гибель зародыша в течение первых 24 часов после инфицирования обусловлена размножением бактериальной микрофлоры, грибов или повреждением при заражении.
   

Вопрос № 2.

Культивирование вирусов на культурах клеток.

Культуры клеток:

В зависимости от техники приготовления и культивирования различают три типа культур клеток и тканей:

1. 
   Однослойные культуры клеток растут на поверхности стекла лабораторной посуды в виде монослоя клеток. Подразделяют на:
   

• 
  Первичные, или первично-трипсинизированные (способны размножаться однократно);
  
• 
  Полуперевиваемые или диплоидные (способны размножаться в течение 40-50 пассажей);
  
• 
  Перевиваемые (способны перевиваться в лабораторных условиях в течение неопределенно длительного срока).
  

Этапы получения:

• 
  Измельчение ткани;
  
• 
  Разъединение клеток путем трипсинизации;
  
• 
  Отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина;
  
• 
  Суспендирование клеток в питательной среде
  

---

2. 
   Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Для суспензионного выращивания клеток в промышленных масштабах (промышленное производство вакцин и диагностикумов) используют биореакторы объемом от 0,5 до 8 тыс. литров;
   
3. 
   Органные культуры кусочки органов животного и человека, выращиваемые вне организма;
   

Вопрос № 3.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций: основные методы.

В лабораторной диагностике вирусных инфекций имеются три основных метода:

1. 
   Обнаружение вируса или его компонентов (вирусных АГ или НК) непосредственно в исследуемом материале;
   
2. 
   Выделение (изоляция) вируса из исследуемого материала и его идентификация;
   
3. 
   Обнаружение АТ к вирусу (серодиагностика вирусных инфекций). Серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни;
   

Прямые методы диагностики клинического материала:

Прямые методы – это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.

1. 
   Электронная микроскопия (ЭМ). С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Одним из вариантов ЭМ является иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), при которой применяются специфические антитела к вирусам.
   
2. 
   Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Метод основан на использовании антител, связанных с красителем. В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой.
   
3. 
   Иммуноферментный анализ (ИФА). Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями.
   
4. 
   Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена.
   
5. 
   Молекулярные методы. В настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
   

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитевых структур и на выявлении их с помощью метки.

---

Непрямые методы диагностики

1. 
   Вирусологический метод
   

Выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация (выделение вируса на культуре клеток, куриных эмбрионах, лаб. животных).

Процесс длительный, иногда требующий проведения нескольких пассажей, прежде чем вирус будет обнаружен и идентифицирован с помощью одного или нескольких методов – в реакции нейтрализации (РН), реакции торможения гемагглютинации (РТГА), РИФ, ИФА или ПЦР.

Серодиагностика

Серологическая диагностика, основанная на реакции антиген – антитело, может быть использована для определения как тех, так и других, и играет роль в определении этиологии вирусной инфекции даже при отрицательных результатах выделения вируса.

Для типирования вирусов применяется:

1. 
   РН;
   
2. 
   Реакция связывания комплемента (РСК);
   
3. 
   Реакция торможения гемагглютинации (РТГА);
   
4. 
   РСК;
   
5. 
   РИФ;
   
6. 
   Реакции пассивной и обратной пассивной гемагглютинации (РПГА, РОПГА);
   
7. 
   Различные варианты ИФА;
   
8. 
   РИА;
   

Вопрос № 4.

Методы обнаружения в патматериале (прямые методы).

Прямые методы:

1. 
   РИФ (реакция иммунофлюоресценции):
   

• 
  Широко применяется для выявления вирусных антигенов в паталогическом материале;
  
• 
  Антитела, меченые флюорохромом, связываются с антигеном, и такой комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе;
  
• 
  Успешное применение РИФ возможно, если в паталогическом материале содержится достаточно большое число инфицированных клеток;
  

2. 
   ИФА (иммуноферментный анализ):
   

• 
  Антитела, меченые ферментами, связываются с антигенами, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата;
  
• 
  Возможно обнаружение растворимых антигенов, таким образом могут использоваться различные виды патологического материала;
  
• 
  Возможно количественное определение антигенов;
  

3. 
   РИА (радиоиммунный анализ):
   

• 
  Метод основан на метке антител или антигенов радиоизотопами;
  
• 
  После взаимодействия Аг и Ат отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность с помощью гамма-счетчиков;
  
• 
  Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител;
  

4. 
   Электронная микроскопия:
   

• 
  Выявление вирионов в пробах;
  
• 
  Ответ через 1 час;
  
• 
  Используют для выявления рота-, адено-, гепанда-, парамиксо-, ортомиксовирусов и др.;
  
• 
  Недостатки метода: для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть не менее 1 млн. вирусных частиц в 1 мл; электронная микроскопия не позволяет типировать вирусы, так как у большинства вирусов нет морфологических различий внутри семейства;
  

---

5. 
   Иммунная электронная микроскопия:
   

• 
  В основе этого метода лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вирусосодержащего материала со специфической сывороткой;
  
• 
  В результате взаимодействия антител с вирусами образуются микропреципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых, своеобразным «венчиком» (антитела связаны с атомами металла);
  

6. 
   Молекулярно-генетические методы (ПЦР):
   

• 
  ПЦР – репликация вирусспецифической последовательности ДНК в 3 этапа;
  
• 
  Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот – выявление комплементарных нитей нуклеиновых кислот с помощью метки (точечная гибридизация, блот-гибридизация, гибридизация in situ);
  

Вопрос № 5.

Выделение вирусов из патматериала. Их индикация и идентификация.

Индикация вируса в патологическом материале:

1. 
   Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae), электронная микроскопия;
   
2. 
   Обнаружение телец-включений. (тельца Бабе-Шенегри при бешенстве);
   
3. 
   Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции;
   
4. 
   Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция);
   
5. 
   Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток);
   
6. 
   Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов);
   

Изоляция (выделение) вируса из патологического материала:

1. 
   Проводится не менее трех слепых пассажей, делается биопроба;
   

• 
  Лабораторные животные (клиника, гибель, пат. изменения);
  
• 
  Куриные эмбрионы (гибель, пат. изменения, РГА);
  
• 
  Культура клеток (ЦПД, РГАд, метод бляшек);
  

Идентификация выделенного вируса – серологические реакции:

1. 
   ЦПД (цитопатическое действие вирусов) - деструктивные изменения отдельных клеток и клеточного монослоя, возникающие в результате продуктивной вирусной инфекции клеток и цитотоксического действия вирионов. В клеточном монослое ЦПД проявляется в форме сплошной или очаговой круглой, или полиморфноклеточной дегенерации, образовании многоядерных клеток или клеточных симпластов, а также в пролиферативном разрастании клеток;
   
2. 
   Метод бляшек - «Бляшки» («негативные» колонии) — участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятнана фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной «бляшки». «Негативные» колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод «бляшек» используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации;
   
3. 
   Реакция гемагглютинации (РГА):
   

---

Смотрите также файлы

• Программа учебной дисциплины оп. 01 Операционные системы и среды.docx

• Пед жадаяттар.docx

• Государственные финансы и государственный бюджет (2 часа).pdf

• Министерство российской федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям.docx

• Лабораторная работа #1 Измерение линейных размеров штангенинструментами.docx