Файл: УМК по вет. генетике.doc

Каким же образом бактерии могли приобрести это свойство? Контакт между ними исключался наличием бактериального фильтра. Возможность обратной мутации штамма 22А была маловероятной, так как он отличался большой стабильностью. Циндер и Леденберг пришли к выводу, что наследственная информация перенесена при помощи фага. Исследования показали, что штамм 22А был лизогенен по фагу Р22. Этот фаг освобождался из лизогенной культуры, проходил через фильтр и лизировал штамм 2А. Присоединив часть генетического материала штамма 2А, фаг возвращался обратно и передавал этот генетический материал штамму 22А. Последний приобретал специфические наследственные свойства штамма 2А, в данном случае способность синтезировать триптофан. Аналогичным образом могут быть трансдуцированы и многие другие признаки, в том числе способность к сбраживанию, устойчивость к антибиотикам и антигенные свойства.

Несколько позднее явление трансдукции было установлено у кишечной палочки и актиномицетов. Функции переносчика генетического материала выполняют Е. coli фаги лямбда (символ λ) и Р-1, у шигелл – Р- 1, у сальмонелл – Р-22.

Известны трансдуцирующие фаги и у других бактерий. Как правило, трансдуцируется один ген, реже два сцеплнных гена и очень редко три. При переносе генетического материала происходит замена участка молекулы ДНК фага. Фаг при этом теряет свой собственный фрагмент и становится дефектным. Включение генетического материала в хромосому бактерии реципиента осуществляется механизмом типа кроссинговера. Происходит обмен наследственным материалом между гомологичными участками хромосомы реципиента и материала привнесенного фагом. Различают три вида трансдукции: общую (неспецифическую), специфическую, абортивную. В результате неспецифической трансдукции в реципиентные клетки могут переноситься различные гены бактерии донора. При специфической трансдукции профаг включается в определенное место хромосомы бактерии и трансдуцирует определенные гены, расположенные в клетке донора рядом с профагом ( фаг λ трансдуцирует локус, обуславливающий способность к сбраживанию лактозы).В этом случае при отделении профагов от ДНК хозяина прилегающие к профагу бактериальные гены вместе с ним выщепляются из состава хромосомы, а часть генов профага остаются в её составе. Частота общей трансдукции составляет от 1 на 1млн. до 1 на 100млн. Специфическая трансдукция происходит чаще. Установлено, что фрагмент хромосомы донора, перенесенный в клетку реципиента, не всегда включается в хромосому реципиента, а может сохраняться в цитоплазме клетки, хотя и не размножается. При деление бактерий он попадает только в одну из дочерних клеток. Такое состояние получило название абортивной трансдукции.

Коньюгация. Коньюгацией называется передача генетического материала от одних бактерий другим при их скрещивании. Впервые процесс коньюгации у бактерий обнаружили Д. Леденберг и Э. Татум в 1946г. Они провели классический эксперимент, который заключается в следующем.

Были отобраны два ауксотрофных мутантных штамма Е. coli К-12: неспособный синтезировать метионин и биотин штамм Met¯ Bio¯ и неспособный синтезировать треонин и лейцин штамм Thr¯ Leu¯ . Оба штамма в течение ночи выращивали вместе на полноценной среде. Затем смешанную культуру центрифугировали, отмывали от полноценной среды и высевали на минимальной питательной среде без добавления метионина, биотина, треонина и лейцина появились прототрофные колонии Met+ Bio+ Thr+ Leu+ с частотой около 1 на каждые 10⁷ родительских клеток. Дополнительные эксперименты показали, что ни трансформации, ни трансдукции в данном случае не происходило. Из этого следовало, что образование рекомбинантных геномов бактерий происходило в результате контакта родительских клеток.

В 1952г. Хейс установил неравноценную роль родительских штаммов при коньюгации. Выяснилось, что один штамм является донором (мужским), а другой – реципиентом (женским). Клетки-доноры обладают половым фактором F. Он является коньюгативной плазмидой и представляет собой циркулярно замкнутую молекулу ДНК. Половой фактор F автономно существует в цитоплазме. Бактериальные клетки с фактором F обозначаются F+, не имеющего его – F-.Они неспособны быть донорами и являются реципиентами генетического материала.

При коньюгации клетки-доноры F+ или Hfr соединяются с клетками- реципиентами F- при помощи коньюгационного мостика – особой протоплазматической трубки, образуемой клеткой F+. В клетке донора Hfr под влияием фермента эндонуклеазы в точке внедрения фактора F происходит разрыв цепи ДНК. Свободный конец одной из цепей ДНК постепенной начинает передвигаться через коньюгационный мостик в клетку реципиента (F-) и сразу достраивается до двухцепочной структуры. На оставшейся в клетке-доноре цепи ДНК синтезируются вторая цепь. Для переноса всей цепи ДНК в клетку реципиента требуется при 37°С 90 – 100мин, но коньюгационный мостик очень хрупкий, легко разрывается и, как правило, вся цепь не успевает перейти. Поэтому и фактор F обычно не передается, так как располагается в конце хромосомы. С более высокой частотой передаются гены, расположенные около начальной О-точки хромосомы донора. Затем ДНК донора в гомологичных участках вступает в контакт с ДНК реципиента и в результате кроссинговера некоторые участки одной цепи ДНК реципиента заменяются фрагментами ДНК донора.

При коньюгации половой фактор вместе с фрагментом ДНК иногда переходит в женскую клетку, превращая ее в мужскую и передавая ей свойства, контролируемые фрагментом хромосомы донора. Процесс переноса генетической информации при помощи полового фактора называется сексдукцией.

Плазмиды. Кроме половых факторов, которые участвуют в скрещивании, большинство бактерий содержит также другие хромосомные элементы, называемые плазмидами. Они представляют собой кольцевые молекулы ДНК, обладают свойствами репликона: могут реплицироваться с помощью ферментов клетки бактерии независимо от основной хромосомы. Маленькие плазмиды включают 10-30 тыс. пар оснований, и в клетке имеется их от 10 до 100 копии. Большие плазмиды содержат до 100 тыс. пар оснований, но в клетке они представлены одной – двумя копиями.

Контрольные вопросы: 1. В чем преимущества микроорганизмов как объектов генетических исследований? 2.Понятие о генотипе и фенотипе бактерий. 3. Чем отличаются вирусы от бактерий? 4. Назовите отличия в генетической организации прокариот и эукариот. 5. Какими путями передается генетическая информация у бактерий. 6. Что такое сексдукция?

Лекция 11

Тема: Генетическая инженерия

Вопросы:

1. Получение и клонирование генов.

2. Векторы. Рекомбинантные молекулы ДНК.

3. Введение в клетку рекомбинантных ДНК и синтез чужеродного белка. 4. Соматическая гибридизация.

5. Использование достижений генной инженерии в животноводстве.

1. Получение и клонирование генов. Генетическая инженерия является новой отраслью молекулярной биологии, которая разрабатывает способы создания лабораторным путём генетических структур и получение наследственно изменённых организмов. Возникновение г. и. связано с прогрессом в развитии генетики, биохимии, микробиологии, молекулярной биологии. Это понятие более широкое,т.к. включает клеточную энзимологию по сравнению с генной инженерией.

Генная инженерия решает задачи: 1. Получение генов путём их синтеза или выделения из клеток. 2. Получение рекомбинантных молекул ДНК. 3. Копирование или размножения выделенных или синтезированных генов или генетических структур. 4. Введение в клетку генов или генетических структур и синтез чужеродного белка.

Получение генов: 1 Химическим путём. 2. Ферментативным путём 3. С помощью трансдуцирующих фагов. Впервые в 1969 г. в Америке Корано с сотр. Синтезировали ген аланиновой тРНК дрожжей химическим путём. Ген включал 77 пар нуклеотидов,соединённых в определенной последовательности ( лигазой) из фрагментов длиной 5-12 нуклеотидов. При введении в кишечную палочку или без клеточную среду ген не работал, т. к. не включал регуляторных элементов (промотора и терминальных концов). В 1976 г. по той же методике они синтезировали отрезок ДНК кишечной палочки, включавший ген супрессорной тирозиновой тРНК протяжённостью в 126 пар нуклеотидов с примыкающими к нему промотором -52 и терминатором – 21 парой нуклеотидов. К концам отрезка присоединили тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. При введении в кишечную палочку ген работал. Однако,этот путь трудоёмок и сложен, им синтезируют только короткие гены.

Ферментативный способ. В 1970 г. Темин, Балтимор, Мазутани обнаружили фермент обратную транскриптазу – ревертазу. В 1972 г. было открыто, что с помощью ревертазы некоторые онкогенные вирусы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы РНК. Затем установили, что матрицами для образования копий ДНК могут служить не только РНК онкогенных вирусов, но и др. РНК, даже синтетические полирибонуклеотиды. Это открыло принципиальные возможности ферментативного синтеза любых генов, используя их РНК копии. Под ферментативным синтезом имеют в виду транскрибирование комплементарной нити ДНК на молекуле РНК в пробирке.

Синтез генов с помощъю трансдуцирующих фагов. В конце 40- х годов прошлого века Чаргафф и Хотчкис показали, что ДНК содержит в небольшом количестве, так называемые минорные основания (5 – метилцитозин, 6 – метиламинопурин), их примерно 0,1% от всех оснований в кишечной палочке. Минорные основания образуются в результате метилирования ( добавления CH₃) цитозина и аденина после завершения репликации. С помощью метилазы бактерия метит ДНК созревших в ней фагов. Если в бактерию проникает фаг без прометилированных участков, то ферменты бактерии рвут ДНК фага на части и она становится не активной. Предполагалось, что эти ферменты узнают ту же последовательность нуклеотидов в ДНК, что и метилаза. Было выяснено, что такими ферментами являются рестриктирующие эндонуклеазы ( рестриктазы). Было выяснено, что участок ДНК который узнаёт эндонуклеаза включает специфическую последовательность из 4-6-8 пар оснований – палиндром- последовательность которая считывается одинаково в обоих направлениях, начиная с 3' конца каждой цепи. Например, рестриктаза E. co .R 1 узнаёт последовательность Г'ААТТ'Ц и режет её симметрично. Если ДНК была кольцевая, то становится линейной. Если на однонитевом участке, разрезанной ДНК, концы имеют последовательность АААА или ТТТТ, то такие концы называют липкими и они без дополнительной обработки с помощью ДНК –лигазы могут замкнуть разрезанную ДНК снова в кольцо. К настоящему времени открыто более 150 рестриктаз, которые позволяют разрезать молекулу ДНК на любые участки (гены) и снова сшивать её. Открытие ревертаз и рестриктаз, которые взаимно дополнили друг друга, послужило важнейшим событием в развитии молекулярной биологии. Биологи 70-е г. назвали эпохой двух Р. Г. Темин и Д. Балтимор в 1975г. за ревертазу, а А. Арбор, Г. Натанс, К. Смит за рестриктазу в 1979г. получили Нобелевские премии. Указанные ферменты позволили использовать индуцирующие фаги в качестве векторов для создания рекомбинантных молекул ДНК.

2. Векторы. Рекомбинантные молекулы ДНК. Рекомбинантные ДНК – это молекула ДНК искусственно полученная путём объединения фрагментов ДНК различного происхождения, как природных так и синтетических. Целью является включение определённых последовательностей ДНК в вектор для их репликации в клетке хозяина. Молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие её репликацию, а может быть и экспрессию называются векторными молекулами. При обычном введении ДНК в клетку, она подвергается атаке ферментов клетки, которые разлагают её до нуклеотидов. В некоторых случаях она «выживает» в клетке, но в процессе деления она не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна встроится в её генетический аппарат и реплицироватся за её счёт или реплицироваться самостоятельно. Векторы – это устройства для доставки чужих генов в клетки различных организмов, т.е. осуществлять введение в клетку дополнительной генетической информации. К векторам предъявляются требования:

- он должен иметь область чувствительную к определённой рестриктазе, которая разрезает вектор, как правило в одном участке, превращая его кольцевую молекулу в линейную, к которой пришивают ген или гены, затем снова замыкают её в кольцо и рекомбинантную ДНК вводят в клетку;

- вектор должен реплицироватся в клетке;

- в составе вектора должен быть маркёрный ген, который после проникновения вектора в клетку, придаёт ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора, т.е. вектор должен иметь селективный признак. ( в присутствии гена β - лактамазы бактериальная клетка приобретает устойчивость к пенициллину, и на среде с пенициллином образует колонии клеток , несущих данный ген, обычные клетки на данной среде погибают. Эффективными векторами являются плазмиды – Coli E1, фаги- λ, SV 40 и др.

3. Введение в клетку рекомбинантных молекул ДНК и синтез чужеродного белка. Основным методом введения рекомбинантных молекул в клетки кишечной палочки и др. бактерий является метод трансформации. Для осуществления трансформации разработаны специальные приёмы( высокотемпературное воздействие, обработка CaCl₂ и др). После транформации отбирают клетки с рекомбинантной ДНК путём: тестирования на резистентность к определенным антибиотикам; использования иммунологических тестов или выявления белка- продукта клонированного гена; гибридизации с зондом ДНК, ком\плементарным участку нужного гена. В качестве вектора используют космиды ( векторная плазмида, содержащая cos – сайт ДНК фага лямбда).