Файл: УМК по вет. генетике.doc

Этапы клонирования генов состоят из: рестриктазного разрезаеия ДНК, выделенной из организма, содержащего нужный ген; обработки теми же рестриктазами, которые использовались для разрезания ДНК; смешивания двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК- лигазой фага Т- 4; трансформации сшитыми молекулами клеток – хозяев; амплификации рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках; отбора клеток с рекомбинантными ДНК вектора для клонирования, который может реплицироватся в клетке хозяина.

4. Соматическая гибридизация. Одно из направлений генетической инженерии. Сущность заключается в соединении лишённых оболочки соматических клеток или их частей с разными хромосомными наборами, т.е. далёких систематически форм ( человека и мыши и др.). Впервые гибриды среди соматических клеток в 1960г. обнаружил Ж. Барский. В культуре клеток двух линий мышей он выявил третий тип клеток, которые содержали хромосомы обеих исходных линий, по морфологическим и биохимическим свойствам клетки занимали промежуточное положение между признаками исходных линий. Спонтанное слияние соматических клеток происходит крайне редко, был найден вирус Сендай ( по фамилии автора), который способствует слиянию клеток. При слиянии двух клеток образуются клетки с двумя ядрами, после митотического деления формируются две одноядерные клетки с набором хромосом исходных родительских форм. Таким путём получают на только клоны гибридных клеток, но и целые растения (гибрид табака и петуньи ). Гибридные клетки могут размножаться длительное время, но межвидовая несовместимость проявляется и при соматической гибридизации, с течением времени в культуре клеток появляются клоны, которые утрачивают хромосомы второго вида, так у гибридных клеток человека и мыши через 100 последовательных делений утрачиваются хромосомы человека.

Использование соматической гибридизации: гибридомная технология получения моноклональных антител, которую разработали в 1975 г. лауреаты нобелевской премии Г. Келлер и К. Мильштейн.

Моноклональные антитела – это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток. Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена.

Гибридомная технология – слияние с помощью полиэтиленгликоля лимфоцитов селезёнки предварительно иммунизированных определенным антигеном организмов с миэломными ( раковыми) клетками, способными к бесконечной пролиферации. Гибридные клетки селекционируют в среде ГАТ ( среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тидимин). Неслившиеся лимфоциты погибают в любой тканевой культуре. Миэломные клетки на этой среде так же погибают,т. к. они были дефектны по ГГФТ (гипоксантин-гуанозин- фосфорибозилтрансферазе). Отбирают клоны клеток, синтезирующие необходимые антитела, которые можно хранить в замороженном состоянии длительное время. Таким образом гибридомы представляют собой бессмертные клоны клеток, синтезирующие моноклональные антитела. Их используют в качестве диагностических средств против болезней.В терапии моноклональные антитела можно соединять с лекарством,благодаря специфичности антител они доносят это вещество непосредственно к раковым клеткам или патогенным микроорганизмам, что позволяет значительно повысить эффективность лечения. Используют моноклональные антитела против H – Y антигена для определения пола у крупного рогатого скота на предимплантационной стадии развтия, а так же стандартизации методов типирования тканей при трансплантации органов, при изучении клеточных мембран ( так были изучены антигены Т- лимфоцитов). Для построения антигенных карт вирусов, возбудителей болезней.Использование генной инженерии в животноводстве. Перспективно клональное размножение животных клеток для генетических манипуляций, но, в отличие от растительных клеток, взрослый организм из них вырастить нельзя, их используют для получения вакцин, интерферона, для изучения токсичности препаратов. В животноводстве важное направление генной инженерии связано с манипуляцией ранними эмбрионами на основе трансплантации.

Трансплантация- метод ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных путём переноса одного или нескольких эмбрионов от высокоценных животных менее ценным. Технология трансплантации включает: гормональное вызывание суперовуляции; использование быков,оцененных по качеству потомства; извлечение и оценку качества эмбрионов, сохранение и пересадку или криоконсервирование эмбрионов для дальнейшей пересадки. Трансплантацию используют в следующих целях: быстрого создания высокопродуктивных стад устойчивых к болезням; получения идентичных животных путем разделения ранних эмбрионов; сохранения мутантных генов малых популяций и генофонда пород; получение потомков от бесплодных, но генетически ценных по генотипу животных; выявление вредных рецессивных генов и хромосомных аномалий; повышение устойчивости животных к болезням; борьба с болезнями путём замены импорта животных на импорт криоконсервированных эмбрионов; определение пола эмбриона и получение животных определенного пола; межвидовые пересадки; получение химерных животных.

На основе трансплантации , методами эмбриогенетической инженерии в животноводстве получают: трансгенных, химерных животных, осуществляют клонирование и генную терапию.

Трансгенные животные – это животные в геном которых с использованием методов генной инженерии перенесена чужеродная ДНК. Трансгеноз – искусственный перенос генов (или ДНК) из бактериальных клеток в эукариотическую клетку (организм) с помощью трансдуцирующих фагов.

Методология получения трансгенных животных с заданными признаками состоит в следующем: клонированный ген вводят в ядро оплодотворённой яйцеклетки; инокулированные оплодотворённые яйцеклетки имплантируют в реципиентнуюженскую особь; отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток , которые имеют клонированный ген во всех клетках; скрещивают животных, несущих клонированный ген в клетках зародышевой линии. Трансгенные животные могут быть получены с использованием ретровирусных векторов, методом микроинъекций ДНК, путём использования модифицированных эмбриональных стволовых клеток.Метод микроинъекций ДНК. Для получения трансгенных животных таким методом необходимо: вызвать гиперовуляцию у самок ( используют сыворотку жерёбых кобыл, а потом хорионический гонадотропин человека); скрестить самок с гиперовуляцией с самцами и вымыть у них оплодотворённые яйцеклетки; провести микроинъекцию ДНК в оплодотворённые яйцеклетки; оплодотворённые яйцеклетки ввести « суррогатным матерям». Следующий этап – идентификация трансгенных животных с помощью блот – гибридизации по Саузерену методом ПЦР. Скрещивая трансгенных животных получают трансгенную гомозиготную линию. Однако при использовании этого метода получают всего лишь около 5% жизнеспособных трансгенных животных. При этом ДНК может интегрироваться в разные места генома, у некоторых животных трансген не эспрессируется.

Метод модификации эмбриональных стволовых клеток. У мышей клетки, взятые на стадии бластоцисты, могут дифференцироваться в любую ткань. Эти клетки называются эмбриональными стволовыми клетками ( ЕS) . Эти клетки у мышей ( стадия бластоцисты) можно генетически модифицировать, встроив в них функциональный трансген. Потом ES – клетки микроинъецируют в бластоцисту реципиента, которую имплантируют в матку « суррогатных» матерей. Трансгенные птицы: Из бластодермы выделяют клетки, трансфицируют их нужным трансгеном и вводят в подзародышевую область облучённой ( лучами рентгена) бластодермы. Получают некоторое количество особей, несущих трансфекцию в клетках зародышевой линии. Последние могут стать родоначальниками трансгенных линий. Трансгенных кур можно использовать для получения высокогомозиготных линий по устойчивости к вирусным инфекциям, кокцидиозу, с высокой конверсией корма, с низким уровнем жира и холестерина в яйце и т. д. Трансгенные овцы, козы и свиньи. Одной изважных задач моекулярной биотехнологии является создание трансгенных животных –« биореакторов» для получения нужных белковых продутов, в т. ч. для медицины. Были созданы трансгенные овцы и козы, способные секретировать в молоке белки человека. Имеются овцы с повышенной скоростью роста шерсти ( кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста 1 поместили под контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы, в результате наблюдалась гиперэспрессия кДНК). В геном свиньи введена генетическая конструкция: регуляторная область гена β - глобина человека, два гена α₁ - глобина человека и один ген β^А - глобина человека. У трансгенных свиней в клетках крови синтезировался в большом количестве человеческий гемоглобин, после очистки его можно использовать для замены крови. От трансгенных овец и коз получают молоко с α₁ - антитрипсином человека, фракционируют белки молока и выделяют чистый ААТ белок человека. Однако получение трансгенных животных пока мало эффективно, только у 5% животных экспрссируется ген человека, из них половина самок,человеческий белок секретируется у малого количества животных. Для повышения эффективности трансгенных животных необходимо клонировать. Особенно перспективно можно использовать трансгенных коров для получения с молоком нужного продукта в необходимых количествах, например человеческого инсулина, белка С, использующегося для предотвращения тромбообразования, фактора IX ( фактора Кристмаса) каскадного механизма свёртывания крови.который необходим больным гемофилией людям.

Химерные животные. Химера – организм, включающий клетки, ткани и органы разных организмов. Польский эмбриолог А. Тарковский разработал метод получения химер ( аллофенных животных) путём слияния различающихся по генотипу эмбрионов (агрегационный метод), английский эмбриолог Р. Гарднер предложил инъекционный метод, предусматривапющий внесение в эмбрионы клеток от другого организма. Мозаицизм у химер наблюдается только в одном поколении, а их потомки не являются мозаиками. Получены межвидовые химеры овцы ( 2n= 54) и козы (2n=60), получен теленок – химера из четырёх половинок двух разных 5- дневных эмбрионов. Масть у телёнка была как у швицкой и голштинской пород, что служит доказательством химеризма. Изучение химер позволит проследить процесс реализации генома в фенотипе животных. Эффективность- в эксперименте из 24570 овоцитов было получено только два телёнка.

Клонирование млекопитающих. Клонирование – совокупность методов, использующихся для получения клонов, путём пересадки ядер соматических клеток в оплодотворённое яйцо с удалённым пронуклеусом, что указывает на плюрипотентность дифференцированных клеток. В 1997 г. Уилмут с сотр. Клонировали овцу Долли методом переноса ядра эпителиальной клетки молочной железы от 6 - летней овцематки породы финский дорсет. Выращивая в культуре клетки, индуцировали их переход в стадию G₁ (критическую). От овцематки шотландской черноголовой породы были взяты яйцеклетки, из которых удалили ядра. В энуклеированные яйцеклетки инъэцировали ядра и воздействовали жэлектрическим разрядом. В культуре клеток или в яйцеводе, с наложенной лигатурой, их культивировали 7 дней, а потом эмбрионы в стадии бластоцисты имплантировали в «суррогатную мать). В эксперименте из 434 яйцеклеток была получена только одна овца Долли, генетически идентичная донору породы финский дорсет. Клонирование животных путём переноса тотипотентных дифференцированных клеток иногда ведёт к снижению жизнеспособности. Не всегда клоны являются точной копией донора из –за изменений наследственного материала и влияния условий внешней среды, варьирует живая масса, темперамент и др.

Генная терапия. Генная терапия направлена на коррекцию генетических дефектов только соматических клеток, поэтому такую процедуру необходимо проводить в каждом поколении. Генная терапия ex vivo предусматривает: получение клеток от больного; исправление генетического дефекта с помощью переноса нужного гена в изолированные клетки; отбор и размножение генетически « исправленных» клеток; инфузия или трансплантация таких клеток пациенту. Генная терапия in vivo предусматривает доставку « терапевтического» гена в клетки ткани пациента. Для этих целей используют вирусные системы доставки: ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированных вирусов, векторы на основе вируса простого герпеса.

Не вирусные системы доставки генов в клетки пациентов: прямое введение путем инъекции ДНК- конструкции в клетки- ткани мишени, в дальнейшем возможно использование в качестве вектора искусственных хромосом, содержащих теломеры, центромеру и точки инициации репликации; использование небольших олигонуклеотидов, способных гибридизироваться с мРНК или специфическим геном, снижая уровень транскрипции или трансляции и уменьшая количество синтезируемого белка (при раке, воспалении, вирусных и паразитарных инфекциях), когда наблюдается гиперфункция нормального белка.

«Антисмысловые» мРНК, которые могут использоваться в качестве лекарственных средств, связываются с мРНК и подавляют трансляцию кодируемого ею белка. Возможно использование и «антисмысловых» олигонуклеотидов как лекарственных средств для лечения вирусных инфекций, малярии, или частично подавляют экспрессию генов наследственных болезней. Разрабатываются подходы к коррекции генетических дефектов в мутантном гене на нужную пару.

Контрольные вопросы: 1.Что такое генетическая инженерия? 2.Какими методами синтезируют гены? 3. Что такое вектор в генной инженерии? 4. Что такое рекомбинантная молекула ДНК, с какой целью они создаются ? 5. Какими путями вводятся рекомбинантные ДНК в клетку? 6. С какой целью создаются трансгенные животные? 7 Что такое химеры? 8. В чём сущность клонирования и генной терапии

Лекция 13

Тема: Мутационная изменчивость.

Вопросы :

1.Теория мутаций.

2. Типы мутаций и их проявление ( классификация мутаций, генные, хромосомные, геномные мутации).

3. Индуцированный мутагенез и его использование

4. Роль репарирующих систем в мутагенезе.

Теория мутаций. Удвоение генетических структур ( репликация) происходит с удивительной точностью, что приводит к постоянству видов. Однако если бы это происходило всегда, то не было бы генетической изменчивости, не было бы эволюции. В действительности стабильность генетического материала при репликации не абсолютна, действуют факторы внешней среды, которые приводят к его изменению. Генетически стойкие изменения в генах и хромосомах называют мутациями. Процесс возникновения, развития и проявления мутаций называется мутагенезом. Измененный организм – мутантом. Впервые скачкообразные изменения наследственных форм было выявлено русским ботаником С.И.Коржинским, который обосновал мутационную теорию эволюции в своём труде « Гетерогенезис и эволюция , 1899г.).