Файл: Приладка (приводка), треппинг и overprint в полиграфии.pdf

10

Если вы анализируете изображение с большими областями, близкими к нулю и с нулевой интенсивностью, то метод автопорога будет стремиться снизить пороги, чтобы включить больше этого неинтересного фона. Если вы визуализируете тот же образец, но только изображение патча интересной части, скажем цитоплазмы, то автопорог, вероятно, даст более высокие пороги и исключит более неинтересный фон, так что пороговые коэффициенты Мандерса будут лучше отражать биологически интересные части данные изображения - верно? Вы можете проанализировать только интересующую область, сделав ROI, а затем выбрав опцию использования ROI в плагине. Вы можете использовать обычную форму (прямоугольник или эллипс) или даже произвольную область, чтобы вручную выбрать интересную часть изображения и игнорировать ту часть, которая, как вы знаете, является фоновой. Да, это субъективное решение, поэтому будьте осторожны! На следующем снимке экрана вы можете видеть, что для того же набора данных о неправильном поведении, при использовании ROI, который приблизительно получает только ячейку, пороговые значения были рассчитаны правильно, а значения tM1 и tM2 являются разумными и ниже 1,00.

Что такое колокализация?

Предположим, что вам дали коллеги несколько изображений, или у вас есть несколько собственных изображений, и вы хотите измерить количество колокализации между двумя красителями или пятнами на изображениях. Сначала вы должны определить, что вы подразумеваете под колокализацией, и это не тривиально. Информацию о том, как начать читать о колокализации и о том, как правильно получить изображения для количественной флуоресцентной микроскопии, подходящие для колокализационного анализа, можно найти здесь:

• Курсы обработки изображений в BioDIP, Дрезден. Недавний обзор Данн в 2011 году.
• Методы колокализационного анализа
• Анализ пространственной корреляции интенсивности пикселей

11

Вот только два из многих коэффициентов колокализации, чтобы выразить корреляцию интенсивности колокализующих объектов в каждом компоненте двухцветного изображения:

Коэффициент корреляции Пирсона. Он не чувствителен к различиям в средней интенсивности или дальности сигнала или смещению нуля между двумя компонентами. Результат равен +1 для идеальной корреляции, 0 для отсутствия корреляции и -1 для идеальной антикорреляции. Шум делает значение ближе к 0, чем должно быть.

Управляет делением коэффициентов. Пропорционально количеству флуоресценции колокализующих пикселей или вокселей в каждом цветовом канале. Вы можете получить более подробную информацию в Manders et al. Значения варьируются от 0 до 1, выражая долю интенсивности в канале, расположенном в пикселях, где интенсивность выше нуля (или порога) в другом цветовом канале.

Эти коэффициенты измеряют количество или степень колокализации, или, скорее, корреляцию и совместное вхождение соответственно (но не должны быть выражены как значения в%, потому что это не так, как они определены). Но если не с чем их сравнить, что они значат?

Costses провел тест статистической значимости, чтобы оценить вероятность того, что измеренное значение корреляции Пирсона, r между двумя цветовыми каналами, значительно больше, чем значения r, которые были бы рассчитаны, если бы было случайное совпадение одной и той же информации.

Этот тест выполняется путем случайного скремблирования блоков пикселей (вместо отдельных пикселей, поскольку интенсивность каждого пикселя соотносится с соседними пикселями) в одном изображении, а затем измерения корреляции этого изображения с другим (нешифрованным) изображением. Вы можете получить более подробную информацию в Costes et al.

12

Результаты этих тестов говорят нам, что коэффициенты Пирсона и Мандерса, которые мы измеряем, лучше, чем чистый шанс, или нет. Другие коэффициенты включают ранговые корреляции, такие как Spearman и Kendal's Tau, Li в ICQ и% интенсивностей или площади (объема) выше одного или обоих пороговых значений (скоро будет Coloc_2). Некоторые другие описаны в литературе, которые использовались в публикациях, но были опровергнуты как нечувствительные, такие как коэффициент перекрытия из бумаги Мандерса, которую J. Adleretal. Показано, что есть большие проблемы в интерпретации по сравнению с коэффициентами расщепления Пирсона и Мандерса. Другие методы включают ICCS (кросскорреляционная спектроскопия изображений) и производную от так называемой PPI (индекс близости белка, оригинальная статья).

Анализ перекрытий на основе объектов

Эта кулинарная книга не охватывает анализ перекрытия на основе объектов, поскольку она требует сегментирования изображения на объекты и фон, что само по себе является целой ветвью обработки изображений. Смотрите плагин JACoP imageJ для объектно-ориентированных методов.

Принцип исключения Паули гласит, что две частицы не могут иметь одинаковые квантовые числа, поэтому они не могут находиться в одном и том же месте. Так что на самом деле ничто не является «действительно» колокализованным.

С другой стороны, вселенная из одного вокселя (не кубическая, конечно) полностью локализована - все внутри нее. Практически наша ситуация лежит между двумя крайностями. Мы должны локализовать в некотором определенном и явном пространственном масштабе: в нашем случае оптическое разрешение или расстояние между пикселями изображения, в зависимости от того, какое значение больше в нм, микрометрах, мм, метрах, км и т. Д. Измерение колокализации, которое мы проводим, означает только что-либо в отношении в пространственном масштабе, над которым мы работаем, так что это должно быть четко указано.

13

Вы можете найти более подробную информацию об оптическом разрешении и расстоянии между пикселями изображения в следующих разделах. Зачем разбрасывать графики вместо цветных изображений слияния? Слишком часто составные / объединенные изображения красного и зеленого каналов считаются достаточными для демонстрации колокализации. Это совершенно неправильно. Помимо проблем с слияниями красного / зеленого изображений для дальтоников, существует еще одна очень веская причина требовать точечных графиков: восприятие человеческого глаза и мозга можно очень легко одурачить (см. рис. 3).

Рис. 3 Цветовая иллюзия

Образец набора данных

Образец набора данных, который должен иметь очень хорошую колокализацию, потому что 2 субъединицы димерного белка окрашены зеленым и красным красителями соответственно. Методы Пирсона, Мандерса, Костеса и Ли должны очень хорошо работать для этого образца, но, может быть, мы можем увидеть некоторые проблемы с данными? Может быть, мы можем решить, подходят ли данные для этого анализа или нет?

14

Откройте этот пример файла данных colocsample1bRGB_BG.tif. Затем используйте команду меню «Image-Color-Split Channels», чтобы получить отдельный стек z для 2 красителей (вы можете выбросить синий!).

При желании вы можете изменить таблицы просмотра изображений (LUT), чтобы один из них был «зеленым», а другой - «пурпурным». Конечно, цвета здесь всегда ложные. Эти ложные цвета полезны только для определения, какой канал какой. Оптоэлектронные детекторы, которые мы используем, видят только фотоны и не знают, какого они цвета; это определяется используемыми нами фильтрами флуоресцентного излучения. Не существует такого понятия, как зеленый или красный краситель, поскольку они имеют широкий спектр излучения, а не одна длина волны, соответствующая определенному «цвету». Если я хочу показать DAPI зеленым, а EGFP - пурпурным, в этом нет ничего «неправильного».

15

Глава 2 ТРЕППИНГ

2.1. Треппинг в допечатной подготовке

Средство от незначительной неправильной приводки – треппинг (см рис. 4). Где два цвета примыкают, более светлый цвет немного расширяется в темнее, чтобы создать наложение. Это дает более темный контур, который считается менее нежелательным, чем белый зазор. Основным исключением является случай, когда используются непрозрачные (цвета, которые полностью затеняют цвета, напечатанные под ними), плашечные цвета. Другие цвета, независимо от их относительной яркости, всегда попадают в эти плашечные цвета (распространяются под ними). Если используется несколько из этих плашечных цветов (обычная практика на рынке упаковки), решающим элементом является порядок слоев печати, а не яркость: первый цвет для печати распределяется под следующим цветом. Ширина треппинг определяется максимальной ошибочной приводки всего рабочего процесса до печати.

Рис. 4 Треппинг и приводка

16

Это гарантирует отсутствие пробелов или перекрытий. Отмена приводки может произойти из-за:

• Механические неточности в фотонаборе или системе CtP.
• Печатные пластины или пленки растягивающие.
• Неточность пленки или пластин.
• Нестабильность печатного станка.
• Размерная нестабильность бумаги или носителя, который напечатан.

Не все процессы печати страдают от неправильной приводки. Довольно часто не беспокоиться о захвате с помощью различных методов цифровой печати. Некоторые компании, вложившие средства в высокопроизводительные четырех- или восьмицветные офсетные печатные машины, также предпочитают не перехватывать файлы. Поскольку перехват фактически вносит в работу артефакты, они считают случайную проблему с неправильной приводки меньшей проблемой, чем визуальное воздействие перехвата всех заданий.

Для захвата элементов макета используются разные методы.

• Как правило, более светлые цвета должны распространяться на более темные цвета. Это минимизирует визуальный эффект захвата.
• Распространение или толстый означает, что элемент немного увеличен или «распространен», так что он перекрывает фон.
• Удушье или тощий означает, что размер элемента немного уменьшен, так что его фон слегка перекрывает объект.
• Много лет назад треппинг была сделана фотографически. Теперь, когда весь контент является цифровым, программное обеспечение заботится о захвате.

17

2.2. Треппинг в печати

Треппинг - это техника печати одной краски поверх другой. Плохое улавливание приводит к тому, что чернила не прилипают должным образом. Это может привести к тому, что чернила образуют маленькие шарики, или их можно слишком легко стереть. Мокрое улавливание относится к чернилам, которые наносятся на другие чернила, которые еще не высохли. Сухая треппинг, очевидно, включает в себя нижележащие чернила, которые уже высохли.

Если цвета, напечатанные на отдельных пластинах, накладываются друг на друга или примыкают друг к другу, неправильная приводка печати может привести к появлению пропусков между цветами в конечном результате. Чтобы компенсировать потенциальные промежутки между цветами в произведениях искусства, типографии используют технику, называемую улавливанием, для создания небольшой области перекрытия между двумя смежными цветами. Вы можете использовать отдельную специальную программу треппинг для автоматического создания треппинг или использовать Illustrator для создания треппинг вручную.

Существует два типа треппинг: спред, в котором более светлый объект перекрывает более темный фон и, кажется, расширяется в фон; и дроссель, в котором более светлый фон перекрывает более темный объект, который попадает в фон и, кажется, сжимает или уменьшает объект.

Команда «Треппинг» создает треппинг для простых объектов, идентифицируя более светлое изображение - будь то объект или фон - и печатая его в более темное изображение. Вы можете применить команду Trap с панели Pathfinder или как эффект. Преимущество использования эффекта «Треппинг» заключается в том, что вы можете изменить настройки треппинг в любое время.

При печати треппинг выражает степень, в которой чернила, уже напечатанные на подложке, воспринимают другой слой, напечатанный поверх нее, по сравнению с тем, насколько хорошо подложка (например, бумага) воспринимает эти чернила.

18

Однако в эпоху программного обеспечения для допечатной подготовки этот термин стал относиться к компенсации за неправильную приводку (когда два слоя чернил не полностью совмещены), которая традиционно называлась «удушья и растекания». Неверная приводка приводит к появлению пробелов или пробелов в окончательной печатной работе. Исправление включает в себя создание перекрытий (спредов) или перекрытий (дросселей) объектов во время процесса печати.

Когда два рассматриваемых цвета являются плашечными цветами, захват всегда необходим: с момента, когда изображение отображается на пленке или пластине, цвета обрабатываются отдельно и печатаются на двух разных печатных узлах. Тот же подход применяется, если один из цветов является плашечным, а другой - технологическим цветом.

Улавливание становится более трудным, если оба цвета являются технологическими цветами, и каждый из них должен быть напечатан как комбинация основных цветов печати: голубого, пурпурного, желтого и черного. В этом случае решение о захвате зависит от количества «общего» цвета. Другим фактором, который влияет на видимость треппинг, является направление треппинг. Решение о том, какой цвет должен быть нанесен или подавлен, обычно основывается на их относительной яркости. Более светлый (более высокая яркость) цвет распространяется в более темный цвет. Это соответствует тому, как человеческий глаз воспринимает цвет: более темные цвета определяют формы, поэтому искажение более светлого цвета приводит к менее заметному искажению в целом. Яркость или темнота цвета определяется как его нейтральная плотность.