Файл: Масс-текст.doc

Чтобы получить масс-спектр надо превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы - ионы. Этот процесс называется ионизацией. Ионизиция по-разному осуществляется в случае газов, жидкостей и твердых тел, органических и неорганических веществ.

Ионизация

Наиболее старый и наиболее широко применявшийся в масс-спектрометрии метод ионизации молекул это, так называемый, электронный удар (ЭУ, по-английски EI - Electron Impact). Этим методом ионизуют вещества в газовой фазе. Если вещество не газообразное, то для того, чтобы его ионизовать, его нужно сначала перевести из конденсированной фазы (жидкость, твердое тело) в газовую фазу, например, испарить нагревом. Затем, получаемый газ нужно ввести в источник ионов, где они подвергаются бомбардировке электронами, которые можно получить нагревая, например, ленточку из тугоплавкого металла. Можно поместить вещество в конденсированной фазе в источник ионов и там его испарить. Электроны - легкие по сравнению с молекулами отрицательно заряженные частицы - сталкиваясь с молекулами выбивают из электронных оболочек электроны и превращают молекулы в положительно заряженные ионы. При этом молекулы часто разваливаются на заряженные фрагменты характерные для каждого соединения. Отрицательные ионы можно получить путем захвата молекулами медленных электронов. Этот процесс также сопровождается распадом молекул (фрагментацией). В результате процесса ионизации получится ансамбль ионов, несущий информацию о структуре молекулы и, часто, настолько характерный для определенного органического соединения, что его называют "отпечатком пальцев", то есть настолько же индивидуальный как рисунок на пальцах человека.

Другой способ ионизации - это ионизация в ионно-молекулярных реакциях, называемая химической ионизацией (ХИ, CI - Chemical Ionization). При этом способе источник ионов заполняется каким-либо газом, называемым газом-реагентом, (например, метаном, изобутаном, аммиаком), который ионизуется все тем же электронным ударом, а молекулы интересующего нас вещества, попадая в источник, превращаются в ионы за счет отбора зарядов от уже находящимися там заряженными ионами-реагентами или с "медленными" ("термическими") электронами. Анализируемых молекул намного меньше, чем молекул газа- реагента, поэтому прямая ионизация их маловероятна. Ионизация передачей на молекулу протонов или электронов в газовой фазе является "мягкой", то есть образовавшиеся ионы не разваливаются на мелкие фрагменты, а вероятнее всего остаются крупными кусками молекул или даже остаются целыми, и присоединяют другие молекулы с образованием кластеров. Этот метод дает меньше информации о структуре молекулы, зато с его помощью легче определить ее молекулярную массу.

Многие органические вещества невозможно испарить без разложения. А это значит, что их нельзя ионизовать электронным ударом. Среди таких веществ почти все биомолекулы (белки, ДНК и т.д.). В последние годы были разработаны специальные методы ионизации таких органических соединений. Для этого используется, в основном, атмосферная ионизация - ионизация в электроспрее (ESI) и лазерная десорбцией с ионизацией из матрицы (MALDI). В первом случае жидкость (интересующие нас соединения в растворителе) под действием электрического поля распыляется из тонкого капилляра и превращается в заряженные капли, содержащие молекулы соединения. В результате испарения растворителя из них молекулы приобретают заряд и превращаются в ионы. В методе MALDI фотоны лазерного луча ионизуют и испаряют матрицу мишени, на которую нанесен образец, а образующиеся из матрицы ионы, как и в методе химической ионизации, ионизуют молекулы образца не разрушая их. ESI и MALDI дали мощный толчок применениям масс-спектрометрии в биологии и медицине. Авторы этих методов ионизации Джон Фенн и Коичи Танака были удостоены Нобелевской премии в 2002 году.

Для ионизации неорганических материалов (металлы, сплавы, горные породы и т.д.) требуются другие методы. Энергии связи атомов в твердом теле гораздо больше и требуется большая энергия для разрыва этих связей и получения ионов. Многие способы ионизации были опробованы и на сегодняшний день лишь несколько из них лазерная десорбция- ионизация и бомбардировка ускоренными ионами и атомами, применяются в аналитической масс-спектральной практике. Для элементного анализа, в котором определяется атомный состав вещества, и изотопного анализа, в котором точно измеряются отношения концентраций разных изотопов, используется метод индуктивно связанной (в которую энергия поступает от ВЧ поля катушки индуктивности, окружающей плазму) плазмы - ICP (атомизация и ионизация в индуктивно связанной плазме с анализом продуктов масс-спектрометром).

Масс-анализаторы

Масс-спектрометр представляет собой вакуумный прибор. Глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра. Разделение ионов по массам (точнее по отношению массы к заряду, или m/z), происходит в той части масс-спектрометра, которая называется "масс-анализатором".

Все масс-анализаторы используют зависимость динамики движения заряженных частиц в магнитных и переменных электромагнитных полях от отношения массы частицы к ее заряду. В первых масс-анализаторах использовалось магнитное поле. Согласно физическим законам траектория заряженных частиц в магнитном поле искривляется, а радиус кривизны зависит от массы частиц. Именно это явление используется для анализа ионов по массам. Для того, чтобы увеличить разрешение (способность разделять ионы близких масс), на пути ионов устанавливается еще и электростатический анализатор энергий частиц. Магнитные масс-спектрометры имеют высокое разрешение и могут использоваться со всеми видами ионных источников, они обладают рекордной чувствительностью, большим диапазоном разделяемых масс ионов, линейной зависимостью сигнала от количества ионов, однако, они громоздки и имеют высокую стоимости.

Ученые в течение долгого времени искали альтернативу магниту в качестве масс-анализатора. Первым успеха добился профессор Стэнфордского университета Robert Finnigan, построивший в 1967 году первый коммерческий масс-спектрометр с квадрупольным анализатором. Квадруполь представляет собой четыре стержня, к которым попарно в противоположной полярности подается определенная комбинация постоянного и радиочастотного переменного напряжений. Ионы, влетающие параллельно оси этих стержней, попадают в гиперболическое поле и оно, в зависимости от соотношения их массы (как всегда, m/z) частоты и амплитуды поля, пропускаются или выбрасываются из анализатора. Масс-спектрометры уменьшились в размерах, стали проще в эксплуатации и, что самое главное, намного дешевле, что открыло возможность использовать этот аналитический метод многим тысячам пользователей.

Дальнейшее развитие квадрупольных анализаторов привело к созданию "ионной ловушки". Одна пара стержней была закручена в кольцо, а вторая пара превратилась в шарообразные чашки. Теперь комбинация радиочастотных и постоянных напряжений, прикладываемых к электродам ионной ловушки, стала позволять удерживать ионы внутри нее или выбрасывать из нее. Первые ионные ловушки, выпущенные фирмой Finnigan в 1983 году, потеряли даже ионный источник. Ионизация молекул стала проводиться прямо внутри ловушки. Впоследствии, правда, от этого отказались, вновь вынеся место, где создаются ионы, за пределы ионной ловушки, что оказалось более выигрышным . Во-первых, внешний по отношению к масс-анализатору, ионный источник гарантирует отсутствие химической самоионизации, приводящей к искажению масс-спектров электронного удара, а во-вторых, делает прибор гораздо более универсальным - можно анализировать отрицательные ионы, образующиеся при диссоциативном захвате электронов, можно использовать классический прямой ввод и т.д.

В ионных ловушках проще осуществить методы, называемые тандемной масс-спектрометрией или МС/МС. Тандемная масс-спектрометрия используется для того, чтобы выявить структуру молекулярных ионов или их фрагментов, выделенных первым масс-спектрометром, с помощью второго, подвергнув эти первичные ионы дополнительной фрагментации. Предположим, мы имеем дело со сложной органической молекулой (биохимики почти всегда имеют дело с такими) и разбив ее на фрагменты, мы все равно не имеем достаточно информации о ее структуре. Из разделенных в первом масс-анализаторе ионов можно выбрать те, которые представляют для нас интерес, каким-нибудь образом заставить их развалиться на более мелкие фрагменты и снова рассортировать то, что получилось, по массам. Это и делается во втором масс-анализаторе. В секторных и квадрупольных масс-спектрометрах МС/МС масс-анализ первичных ионов и продуктов их диссоциации- вторичных ионов производится последовательно в пространстве и анализаторы следуют друг за другом. В ионной ловушке процедуру МС/МС можно осуществлять внутри одной ловушки, разделив анализ первичных и вторичных ионов во времени. В ионной ловушке можно удерживать ионы, которые представляют интерес, а остальные "выбросить" из нее. Оставшиеся в ловушке ионы можно подвергнуть распаду (управляемой фрагментации), оставить в ловушке те, которые представляют интерес, подвергнуть их фрагментации и проанализировать продукты. Этот процесс можно продолжать многократно, фрагментируя ионы до мелких фрагментов. Многократная фрагментация называется МСⁿ. Прогресс в протеомике во многом обязан тандемным системам, основанным на ионных ловушках.

В последнее время все большую популярность приобрели "времяпролетные" (Time Of Flight, TOF) масс-анализаторы. В них ионы разгоняются электрическим полем, приобретают одинаковую не зависящую от массы кинетическую энергию и вылетают в бесполевое пространство. При движении в этом пространство ионы имеют зависящую от массы скорость, определяемую известной формулой E=mv²/2, где Е- кинетическая энергия ионов, м- масса иона, а v - его скорость. Они разделятся пространстве и в разное время достигнут детектора, расположенного в конце бесполевого пространства. Измерив время прихода на детектор, при известной длине бесполевого пространства можно определить их массу. С помощью этого анализатора можно измерять массы очень больших молекул (с массами в десятки и сотни тысяч атомных единиц). В квадрупольных анализаторах большие молекулы не удается удерживать доступными электрическими полями. Магнитные анализаторы для ионов больших масс (больше 10 кило Дальтон) очень громоздки и требуют мощных источников тока и напряжения. Наиболее подходящим методом ионизации для времяпролетных масс-спектрометров оказался описанный выше MALDI (ионизация лазерной десорбцией из матрицы).

Самыми точными, обладающим наиболее высоким разрешением, в настоящее время являются масс-спектрометры ионного циклотронного резонанса. В этих приборах измеряется частота вращения ионов в магнитном поле. Точность измерения масс достигает 10^-6, а разрешающая способность миллиона. Эти приборы являются и самыми дорогими, так как в них используются сильные магнитные поля (от 30000 Гаусс до 25000 Гаусс). Для создания таких сильных полей нужны сверхпроводящие соленоиды, охлаждаемые жидким гелием и жидким азотом.