Файл: Учебное пособие для высших сельскохозяйственных учебных заведений по специальности Ветеринарная медицина.pdf

163 0,08 91 0,30 340 1,05 1170 0,09 103 0,35 400 1,10 1230 0,10 114 0,40 450 1,15 1290 0,11 130 0,45 500 1,20 1340 а) Метод радиальной иммунодиффузии
В основу метода положен метод Манчини, который основан на измерении диаметра коль- ца преципитации, образующегося при внесении исследуемой молочной сыворотки в лунки, выре- занные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворот- ка. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуног- лобулина. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов.
Подготовка к анализу:
Приготовление агара с моноспецифической антисывороткой к иммуноглобулинам клас- сов А, G, М.
3% агар «Дифко» или агарозу на 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 смешивают нагретым до температуры 56°С в соотношении 1:1 с моноспецифической антисывороткой, в которой концентрация антител вдвое превышает рабочий титр (указанный на этикетке). Разведе- ния антисыворотки делают на 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6. Агар, смешанный с моноспецифической антисывороткой, распределяют равномерным слоем на стеклянных пластин- ках размером 9х12 см. Для этого на пластинку помещают латунную иди пластмассовую П- образную рамку толщиной 1мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между пластинками заливают смесью агара и антисыво- ротки в количестве 9 мл.
Приготовление молочной сыворотки:
Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 80-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и центри- фугат нагревают до 37°С. Затем по каплям добавляют 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Казеин осаждают центрифугированием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.
Проведение анализа:
В слое агара с моноспецифической антисывороткой пробойником вырезают рядом две лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помо- щью микрошприца по 2 мкл стандартной не разведенной и разведенной 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 моно- специфической сыворотки. Лунки следующих рядов заполняют испытуемой молочной сыворот- кой объемом по 2 мкл. Пластинки инкубируют во влажной камере в течение 24 ч при температуре
4°С, а пластинки с антисывороткой - к иммуноглобулину М-48 ч.
Обработка результатов:
После окончания инкубации измеряют диаметр колец преципитации. По данным разведе- нии стандартных сывороток строят калибровочные кривые, выражающие зависимость между концентрацией иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации. Для этого на полуло- гарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартной сыворотки, а по оси ординат - известное количество иммуноглобулинов (МЕ/мл или мг/мл), содержащиеся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Для каждого класса иммуноглобулинов строят отдельный график.
Для определения уровня иммуноглобулинов в испытуемой молочной сыворотке на оси абсцисс откладывают диаметр кольца преципитации, затем восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой и точку пересечения проектируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулина каждого класса, выраженной в МЕ/мл или мг/мл.
По данным Н.А. Сапожниковой (1992), концентрация иммуноглобулинов класса G в мо- локе клинически здоровых коров составляет: после родов - 7,9710,31 мг/мл, в середине лактации -
1,78+0,09 мг/мл, в период запуска - 8,28+0,38 мг/мл, у больных субклиническим маститом -
15,02+0,87,2,56+0,09 и 11,87+0,59 мг/мл, иммуноглобулинов класса М соответственна 0,3й±0,03,
0,14±0,01, 0,34±0,04 мг/мл и 0,53+0,04, 0,23+0,01 и 0,39±0,05 мг/мл. б) Химический метод по Бадин и Раусселет.
1) Приготовление цинк-салицилового реактива.

164 1,875 сульфата цинка растворяют в бидистиллированной воде, вносят 57,14 г салицилово- го натрия, доливают водой до 900-950 мл. Измеряют рН, доводят 0,1н раствором едкого натра до
7,3, после доводят раствор до 1 л в мерной колбе бидистиллированной водой.
2) Приготовление раствора кальция хлорида.
2 мл официального 10% раствора кальция хлорида (фиксанола) смешивают с 117 мл би- дистиллированной воды.
3) Приготовление тимолового реактива.
Сначала готовят 10% раствор тимола на 96° спирте. Затем 1 мл спиртового раствора рас- творяют в 80 мл веронал-мединалового буфера, встряхивают и .доводят до 100 мл.
4) Приготовление веронал-мединалового буфера.
2,76 г веронала растворяют в 1-литровой колбе в небольшом количестве бидистиллиро- ванной воды, затем прибавляют 2,06 г мединала, после растворения определяют рН и доводят вероналом или мединалом до 7,5, раствор доводят до метки 1 л бидистиллированной водой.
5) Приготовление цинкового реактива.
0,28 г веронала, 0,21 г мединала и 0,024 г сульфата цинка растворяют в 1 л бидистиллиро- ванной воды, доводят до рН 7,5 вероналом или мединалом.
6) Приготовление раствора сернокислого аммония.
189,0 г сернокислого аммония и 29,3 натрия хлорида растворяют в 1 л бидистиллирован- ной воды.
7) Приготовление молочной сыворотки.
Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в моро- зильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Жир снимают с помощью шпателя, снятое молоко подогревают до 37°С и добавляют уксусную иди соляную кислоту по каплям, доводя рН до 4,6. Казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр. Доводят рН сыворотки до 7,2-7,3 0,1н раствором едкого натра.
8) Построение калибровочных кривых.
Используют эталонные сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов классов
А, G, М. К 1 мл эталонной сыворотки добавляют 1 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают и 1 мл разведении добавляют к 1 мл физиологического раствора и т.д. до 7-й пробирки. Затем определяют оптическую плотность полученного разведения сывороток в физио- логическом растворе колориметрически при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр) и строят калибровочные кривые зависимости величины оптической плотности от концентрации иммуноглобулинов А, G, М.
Проведение анализа:
1) Определение иммуноглобулина G. в пробирку № 1 вносят 5 мл цинк салицилового реактива, добавляют 1,1 мл молочной сы- воротки, выдерживают 1 мин и колориметрируют при длине волны 400-470 мл (синий свето- фильтр). В пробирку № 2 вносят 6 мл тимолового реактива, добавляют 0,05 мл молочной сыворот- ки и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр).
2) Определение иммуноглобулина М. В пробирку № 3 вносят б мл цинкового реактива, добавляют 0.05мл сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий свето- фильтр).
3) Определение иммуноглобулина А.
В пробирку № 4 вносят 6 мл раствора сернокислого аммония, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470нм (синий светофильтр
Обработка результатов:
Для каждого класса иммуноглобулинов проводят расчет оптической плотности иссле- дуемых растворов, а затем по калибровочной кривой с учетом этих данных определяют их коли- чественное содержание.
Иммуноглобулин G.
Д
G
= Д
2
х 2 + Д
1 где Д
G
- оптическая плотность иммуноглобулина G;
Д
2
- оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке№ 2;
Д
1
- оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 1;
2 – коэффициент.
Иммуноглобулин M
Д
M
= Д
3
х 2 где Дм - оптическая плотность иммуноглобулина;
Дз - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 3;
2 – коэффициент.

165
Иммуноглобулин А.
Да= Д
4 х 2 где Да- оптическая плотность иммуноглобулина А;
Д
4
- оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 4;
2 - коэффициент.
Определение лактоферрина
В основу метода положен метод Манчини, который основан на изменении диаметра коль- ца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки молока, в луночки, выре- занные в слое агара, в котором предварительно диспергирована специфическая антисыворотка.
Подготовка к анализу:
1) Приготовление агара со специфической антисывороткой. Свежий 3% гель агар «Диф- ко», приготовленный на 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1 М поваренной соли и 0,01%мертиолята натрия, охлаждают до 52°С, смешивают с равным объемом антисыворотки, разведенной в 60 раз и нагретой до этой же температуры, и выливают на стеклянную пластину.
Предварительно на пластинку помещают П-образную латунную или пластмассовую рамку толщи- ной1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между стеклянными пластинами заливают смесью агара с антисывороткой.
2) Приготовление молочной сыворотки.
Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в моро- зильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпав- ший осадок казеина центрифугируют, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.
3) Построение калибровочного графика.
Для построения калибровочного графика используют стандартный лактоферрин в концен- трациях 175, 350, 700, 1400, 2800 мкг./мл, разведенный в 0,033 М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1 М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия.
Проведение анализа:
В слое агара с антисывороткой пробойникам вырезают рядами лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2 мкл разведения стандартного лактоферрина. Лунки следующих рядов заполняют исследуемыми мо- лочными сыворотками в том же объеме. Агаровые пластины выдерживают при комнатной темпе- ратуре 18-20°С во влажной среде в течение 4-3 ч, затем окрашивают амидо-черным Б.
Обработка результатов:
С помощью чертежного измерителя или штангенциркуля измеряют диаметры колец пре- ципитации. Строят калибровочный график зависимости логарифма концентрации стандартного лактоферрина в различной концентрации от квадрата диаметра колец преципитации о антисыво- роткой.
На полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципи- тации стандартным лактоферрином, а по оси ординат - известное количество лактоферрина, содержащееся в каждом разведении. Образующиеся точки соединяют прямой.
Определение концентрации лактоферрина в испытуемых молочных сыворотках опреде- ляют с помощью калибровочного графика.
У клинически здоровых коров после родов и в середине лактации количество лактоферри- на составляет 53-65 мкг/мл, у больных маститом - 251-330 мкг/мл, к концу лактации (период запуска) оно возрастает до 481,9±34,5 мет/мл и 2559,0±170,4 мкг/мл соответственно.
Определение активности лактопероксидазы
а) Метод Б.П. Плешкова.
Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина с перекисью во- дорода при участии лактопероксидазы с образованием вещества, имеющего максимум поглощения при 520 нм.
Подготовка к анализу:
1) Приготовление 2,5 мМ раствора бензидина.
184,2 мг бензидина растворяют в смеси 100 мл дистиллированной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения бензидина раствор охлаждают, растворяют в нем
5,45 г трехводного уксуснокислого натрия и доводят общий объем раствора дистиллированной водой до 400 мл.
2) Приготовление 0,333н перекиси водорода.
К 0,6 мл перекиси водорода добавляют 99,4 мл дистиллированной воды. Концентрацию перекиси определяют титрованием 0,1н раствором перманганата калия (НКМn0 4
). На титрование

166 3,0 мл 0,333н перекиси водорода должно пойти 10,0 мл 0,1н раствора перманганата калия. По результатам титрования раствор перекиси водорода доводят до нужной концентрации дистилли- рованной водой.
3) Приготовление молочной сыворотки.
Пробу молока центрифугируют в течение 15мин при 2000 об/мин, ставят в моро- зильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.
Оборудование и аппаратура:
1)
Спектрофотометр с термостатируемой кюветой.
2)
Секундомер.
3)
Ультратермостат.
4)
Бюретка для титрования.
5)
Пробирки химические.
6)
Весы аналитические.
Проведение анализа:
В термостатируемую кювету с рабочей длиной 10мм наливает 2,0 мл раствора бензидина и 0,5 мл раствора перекиси водорода, предварительно подогретых до температуры 37°С. Содер- жимое кюветы перемешивают и устанавливают на спектрофотометре при длине волны 520 нм нулевую отметку шкалы оптической плотности. Затем в кювету добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки молока, перемешивают и ровно через 60 с (по секундомеру) определяют оптическую плотность.
Аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плотности контрольной про- бы, содержащей вместо сыворотки молока 0,1 мл дистиллированной воды.
Обработка результатов:
Активность лактопероксидазы рассчитывают по формуле и выражают в условных едини- цах активности (УЕА).
(Ео-Ек) х 10
УЕА = ------------------------------- ,
60 где УЕА - активность фермента, Ед ОП/мл;
Ео
- оптическая плотность опытной пробы;
Ек - оптическая плотность контрольной пробы;
10 - коэффициент пересчета в 1 мл;
60 - время проведения реакции, с.;
УЕА - изменение оптической плотности на 0,01 за 1 с одним мл сыворотки молока. б) Модифицированный метод Орам и Рейтер.
Подготовка к анализу:
1) Приготовление 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,7. 6,8 г двузамещенного фосфорнокис- лого калия (КН
2
РО
4
) растворяют в 500 мл дистиллированной воды и 11,4 г водного однозамещен- ного фосфорнокислого калия (КН
2
РО
4 х 3Н
2
О) растворяют в 500 мл дистиллированной воды. В раствор двузамещенного фосфорнокислого калия под контролем рН-метра приливают раствор однозамещенного фосфорнокислого калия до установления рН 6,7.
2) Приготовление 0,01% раствора ортодианизидина. 10 мг орто-дианизидина растворяют в
100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,7.
3) Приготовление молочной сыворотки.
Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в моро- зильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпав- ший в осадок казеин отделяют центрифугированием, асыворотку молока фильтруют через бу- мажный фильтр.
Проведение анализа:
К 3 мл 0,01% раствора орто-дианизидина добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки моло- ка, тщательно перемешивают и определяют экстинцию на спектрофотометре при длине волны 460 нм с рабочей длиной кюветы 10мм. Затем в кювету доливают 0,1 мл 9 мМ перекиси водорода, хорошо перемешивают и выдерживают в водяной бане или термостате при температуре 37°С 5 мин. Снова измеряют экстинцию при той же длине волны.

167
Обработка результатов:
Активность лактопероксидазы выражают в условных единицах активности (УЕА) и опре- деляют по формуле:
До – Д
5
УЕА = ————————,
5 где - До - начальная экстинция молока;
Д
5
- экстинция через 5 мин;
5 - время инкубации образца при температуре 37°С, мин.
УЕА - изменение экстинции на 0,001 единицы за 1мин одним мл сыворотки молока.
В молоке клинически здоровых коров в середине лактации активность лактопероксидазы составляет 535,0±44,0 УЕ, а у больных субклиническим маститом 964,0±32,0 УЕ