ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 29.10.2023
Просмотров: 24
Скачиваний: 3
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
1 слайд. Название презентации
2 слайд. Метод молекулярной гибридизации основан на уникальном свойстве генетического материала организма – молекулы ДНК –, состоящей из мононуклеотидов, образовывать двойную спираль с комплементарно соединенными азотистыми основаниями.
3 слайд. Этапы реакции молекулярной гибридизации на мембранах:
А. Выделение ДНК.
Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК(не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.
В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация.Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран. Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 800С или УФ светом.
Г. Гибридизацияпроводится в несколько этапов: – обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК; – приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд; – программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 650С.
Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета.
4 слайд. При диагностике инфекционных заболеваний применяется метод дот-гибридизации. Это метод точечной (дот) гибридизации, который выполняется путем внесения исследуемых образцов ДНК в денатурированном состоянии на капроновые мембранные фильтры в виде точек. Например, ДНК микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота в количестве 3 мкл (1,8 мкг/мл) в виде точек наносится в квадраты (1,5 х 1,5 см).
5 слайд. Удобным для работы является метод гибридизации с использованием фильтров. При этом один из препаратов ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозных фильтрах
, на которых молекула ДНК адсорбируется. Фильтры с адсорбированной одноцепочечной ДНК обрабатывают таким образом, чтобы предотвратить дальнейшую адсорбцию одноцепочечных молекул.
А - иммобилизованная на фильтре одноцепочечная ДНК;
Б - одноцепочечная ДНК в растворе;
В - фильтр с иммобилизованной одноцепочечной ДНК опускается в раствор, содержащий денатурированную молекулу ДНК.
Фильтр с адсорбированной ДНК погружают в раствор, содержащий второй препарат денатурированной ДНК (ДНК-зонд). Связывание ДНК-зонда происходит только в том случае, если он имеет комплементарную последовательность с первоначально адсорбированной на фильтре молекулой ДНК.
6 слайд. Метод молекулярных, или генных, зондов (ДНК-зондов) – основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом), несущим наиболее специфический и консервативный для данного вида бактерий ген, с ДНК изучаемого микроорганизма.
Методы ДНК-зондов сводятся к следующему:
получение односпирального фрагмента ДНК определенного вируса и его метки — это ДНК-зонд;
выделение из исследуемого материала нуклеиновых кислот и их денатурация;
контакт образовавшихся односпиральных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55—65 °С, приводящих к образованию двуспиральных молекул (гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности;
удаление всех негибридизированных односпиральных молекул нуклеиновых кислот (отмывают или добавляют нуклеазы);
обнаружение (по метке) образовавшихся двуспиральных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в исследуемом материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.