Автор: Макеева Полина Александровна, 11 класс

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ПРОДУКЦИИ БЕЛКА В РАСТЕНИИ: ОТ МОДЕЛЬНОГО GFP К ЦЕЛЕВОМУ ИММУНОГЛОБУЛИНУ G.

ГБОУ Школа № 141

Город Москва

2019 г.

Научные руководители:

Николай Валентинович Ледуховский

Татьяна Валерьевна Комарова
СОДЕРЖАНИЕ

1 – Введение……………………………………………………….….2

2 – Цели, задачи, методы исследования…………………………….4
3 – Оборудование……………………………………………………..6
4 – Ход работы………………………………………………………..7

5 – Вывод……………………………………………………………..14

6 – Литература………………………………………………………..15

АКТУАЛЬНОСТЬ

С помощью генной инженерии человек научился продуцировать необходимый ему белок в системе, которая этот конкретный белок не воспроизводит. Наиболее часто используемые системы для производства целевых белков — дрожжи, бактерии и клетки млекопитающих. Однако в случае бактерий производство белка эукариотической клетки сильно ограниченно его (белка) простотой, вследствие чего в бактерии нельзя продуцировать сложные белки, которые должны быть правильно свернуты, проходить стадию сборки или иных модификаций. К подобным белкам относятся и антитела. Кроме того, из-за слишком высокого уровня накопления целевого белка в клетках бактерий, этот белок может формировать нерастворимые образования (тельца включения), которые надо переводить в активную растворимую форму, а также удалять специфические бактериальные токсины, присутствующие в тельцах включения.

Дрожжи — эукариоты, и некоторых вышеперечисленных недостатков бактериальной системы у них нет, но очень большое количество белка деградирует спустя короткое время после их производства. Кроме того, образование правильной структуры белка (фолдинг) и необходимые для его функционирования модификации могут не проходить должным образом.

В клетках животных так же можно производить белок, и как раз культура клеток млекопитающих является основной системой, в которой в настоящее время производятся большинство сложных белков, используемых в качестве лекарственных препаратов. Однако, эта система предполагает существенные финансовые затраты вследствие невысокой продуктивности и также необходимости соблюдения стерильности. В итоге, стоимость препаратов, произведенных в культуре клеток млекопитающих, очень высока. В связи с этим, ведется постоянный поиск альтернативных систем продукции. Одной из многообещающих и перспективных платформ являются растения.

---

Помимо снижения себестоимости конечного продукта, растения гарантируют биобезопасность продуцируемого в них белка, т.к. не содержат компонентов животного происхождения, например, нуклеиновых кислот клеток-продуцентов или их вирусов и прочих потенциально возможных загрязнений. Кроме того, растительная клетка так же как и животная является эукариотической, механизмы синтеза и последующих модификаций белка принципиально не отличаются от таковых для животной клетки. Растительная клетка способна производить (и запасать) большое количество белка, в т.ч. сложные белковые молекулы. Растение — самостоятельная система, способная наработать целевой белок в больших количествах при создании минимальных (по сравнению с культурой клеток млекопитающих) условий для роста и развития (свет, вода и минеральные вещества).

В своей работе я провожу анализ различий в наработке целевого (иммуноглобулин G) и модельного белка (GFP), а также подбираю оптимальные условия для высокого выхода необходимого белка в растительной системе.

ЦЕЛИ:

Исследование оптимальных условий для временной продукции белка животного происхождения растением Nicotiana benthamiana на примере GFP и иммуноглобулина G человека.

ЗАДАЧИ:

Определение оптимального разведения суспензии агробактерии и продолжительности наработки:

а) модельного белка GFP,

б) целевого иммуноглобулина G человека в листьях растения.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

• 
  Инфильтрация: введение суспензии агробактерии (Agrobacterium tumefaciens) в межклеточное пространство листа. Agrobacterium tumefaciens позволяет переносить кольцевую ДНК (плазмиду), содержащую ген целевого белка, в клетки растений (в их ядро).
  
• 
  Электрофорез: способ разделения заряженных молекул белков под действием электрического тока, в данной работе средой является полиакриламидный гель (ПААГ)
  
• 
  Высечка: фрагмент листа (в данном случае 1 см в диаметре) растения из зоны инфильтрации суспензией бактерий
  
• 
  GFP: зелёный флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein) медузы Aequorea victoria.
  
• 
  Иммуноглобулин G: антитело человека; в данной работе антитело, используемое при терапии рака молочной железы человека.
  

---

ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ

• 
  Денситометр: прибор для измерения оптической плотности.
  
• 
  Флуориметр: измеряет интенсивность флуоресценции белка в растворе.
  
• 
  Ультрафиолетовая лампа: излучает свет с длиной волны 360 нм.
  
• 
  Чашка Петри.
  
• 
  Механический дозатор.
  
• 
  Аппарат для проведения электрофореза белков.
  
• 
  Целит: абразив.
  
• 
  Краска Кумасси: раствор, содержащий краситель Кумасси, используемый для окрашивания белков.
  
• 
  Буфер (1×PBS; 1×GFP): содержат необходимый для экстракции набор солей и поддерживает постоянную pH.
  
• 
  Среда LB: питательный раствор для выращивания культур бактерий.
  
• 
  Полиакриламидный гель: гель, полученный за счет полимеризации акриламида, используется для разделения белков методом электрофореза.
  
• 
  Вирусные векторы 11932 для продукции GFP и 11333 с 11520 – для продукции иммуноглобулина (кодируют лёгкую и тяжёлую цепь, соответственно): генетические конструкции на основе геномов вирусов растений, содержащие ген целевого белка. Используются для повышения уровня продукции, т.к. способны сами мультиплицироваться в клетке растения.
  

ХОД РАБОТЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ:

ЭКСПЕРИМЕНТ С GFP.

GFP — компактный и стабильный белок, который должен нарабатываться клеткой в большом количестве. Иными словами, ожидается высокая производительность белка растением даже при низкой плотности суспензии бактерии (высоком разведении). Учитывая, что во всех экспериментах используются вирусные векторы, которые при попадании в клетку могу мультиплицироваться и переходить из клетки в клетку, до достаточно доставить ДНК с геном целевого белка лишь в небольшое количество клеток.

Первый день эксперимента, в жидкую питательную среду для бактерий (LB) c 3-мя видами антибиотиков (Гентамицин 25 мкг/мл, Рифампицин 50 мкг/мл; Канамицин 100 мкг/мл) была засеяна агробактерия с плазмидой. Антибиотики нужны для того, чтобы в среде выросли только агробактерии (за это отвечают гентамицин и рифампицин), содержащие плазмиду с геном целевого белка (за это отвечает канамицин).

---

На следующий день измерена оптическая плотность (мутность суспензии) полученной ночной культуры агробактерий в среде LB с помощью денсинтометра при длине волны 600 нм. Плотность бактерий при разведении в 10 раз: 0,38, при разведении в 100: 0,038 далее вне чувствительности прибора. Разведение проводилось буфером для инфильтрации.

Разведения агробактерий в 10, в 100, в 1000 и в 10000 раз были введены в листья 4 растений Nicotiana benthamiana, в различные зоны листа с помощью шприца без иглы (рис. 1).

Рисунок 1. Инфильтрация. Схема инфильтрации. Лист в УФ свете на 6 день. Сбор проб проводился на 4 день после агроинфильтрации. Всего 16 проб, 4 листа, с каждого листа по 4 пробы (высечек). Названия проб: А(тип инфильтраций); 1 (номер растения); 1 тип инфильтрации. Пример: А;1-1.

На 4 день (спустя 3 полных суток) сняты пробы с 1 – 4 растений, номера 5 и 6 были оставлены для дальнейшего наблюдения и производства белка. Добавлена пробирка -К (отрицательный контроль, материал, собранный с незараженного листа). Собраны только концентрации 10 – 1000 раз, так как использовался «сильный» вектор, и концентрация разведения высока, вследствие чего ожидается высокий выход белка. (Пробы с разведением в 10 тыс. были сняты на 11 день, 31 октября 2017 г.)

5 и 6 номер были оставлены для того, чтобы увидеть, как себя поведёт растение с течением времени в различных зонах инфильтрации.

Отрицательный контроль — проба с неинфильтрированного участка.

Для того, чтобы возможно было измерить количество GFP необходимо получить экстракт:

• 
  Растереть пробы с целитом (абразивным порошком).
  
• 
  Добавить буфер для экстракции GFP (300 мкл)
  
• 
  Центрифугировать 10 минут при 14 тысячах оборотах в минуту для осаждения нерастворимых компонентов.
  
• 
  280 мкл из полученного экстракта переместить в кювету для измерения на флуориметре, добавив 720 мкл буфера.
  

---

Количество GFP было измерено за счёт флуоресценции. Флуоресценция GFP была измерена с помощью флуориметра, который возбуждает свечение GFP светом с длиной волны 390 нм, а улавливает флуоресценцию в диапазоне 490-520 нм, который соответствует пику флуоресценции GFP. Для этого используются фильтры типа “narrowband” (NB 390 нм и NB 520 нм).

Желтым обозначены мутные образцы, которые могли быть неверно измерены. В таблице приведена абсолютные значения, полученные с прибора.

	Раст. № 1	Раст. № 2	Раст. № 3	Раст. № 4
В 10 р.	190	90	116	200
В 100 р.	95	150	55	178
В 1000 р.	78	35	23	76
В 10000 р.	190	30	50	220

Для того, чтобы можно было сравнивать листья между собой, провели нормировку на значение, которое дает первое разведение (в 10 раз), а затем определили относительные средние значении по 4 растениям (см. таблицу и график ниже).

---

Смотрите также файлы

• Введение современная война характеризуется решительностью действий, направленных на достижение цели, охватом больших территорий, применением различных родов войск и видов вооруженных сил, высокой динамичностью..docx

• История изобретения транзистора.rtf

• Контрольная работа по дисциплине Налоги и налогообложение Задание.doc

• 1. Введение в деловое общение Задание Установка в деловом общении это определенное эмоциональное отношение к деловому партнеру как к личности. Она может быть разной.docx

• Контрольная р.docx