Добавлен: 08.11.2023
Просмотров: 32
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
| | Раст. № 1 | Раст. № 2 | Раст. № 3 | Раст. № 4 | | среднее (без учета мутных) |
| В 10 р. | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | :10 | 1,0 |
| В 100 р. | 0,5 | 1,7 | 0,5 | 0,9 | :100 | 0,9 |
| В 1000 р. | — | 0,4 | 0,2 | 0,4 | :1000 | 0,3 |
| В 10000 р. | 1,0 | — | — | 1,1 | :10000 | 1,1 |
| нормировка на первое разведение (в 10 раз) | ||||||
Из этой части эксперимента следует, что для модельного белка GFP можно использовать высокие разведения суспензии агробактерии, т.к. используемый «сильный» вектор обеспечивает достаточный уровень продукции. Исходя из полученных результатов выгоднее использовать низкие концентрации, это доказывает уровень продукции при разведении в 10 тысяч, который сравним или выше, чем уровень продукции при разведении в 10 раз. Кроме того, на 11 день после инфильтрации на некоторых листах даже при разведении в 10 тысяч появились некрозы, а при более высокой плотности суспензии наблюдались некрозы во всех случаях. Скорее всего, некрозы возникают за счет стремительного накопления большого количества чужеродного белка в клетке. При более высоких разведениях (низкой плотности суспензии) достигается такой же уровень продукции, но за более длительное время. Таким образом, предположения насчёт модельного белка оказались верны, но неожиданностью стало то, что результат при разведении в 10000 оказался сравним или даже выше, чем при разведении в 10 раз.
ЭКСПЕРИМЕНТ С ИММУНОГЛОБУЛИНОМ G
Иммуноглобулин — крупный, сложный многокомпонентный белок, а значит растению будет сложнее производить его, и это будет намного затратнее по времени. Скорее всего, количество наработанного белка будет прямо пропорционально разведению.
Для получения иммуноглобулина (рис. 2) необходимо ввести в клетку два гена: ген легкой цепи и ген тяжелой цепи. Для этого используются 2 бактерии: с плазмидами, одна из которых содержит ген легкой цепи, другая – тяжелой. Здесь использовались также как и в случае с GFP вирусные векторы, способные мультиплицироваться в клетке (векторы 11520 и 11333, тяжёлая и лёгкая цепь соответственно). Агробактерия с высокой вероятностью агробактерия обе цепи доставит в одну клетку, где они будут собраны растением. Перед тем, как ввести суспензию в лист, векторы (количество бактерий в суспензиях примерно одинаково) смешивают, и только потом вводят в лист.
Рис. 2. Схематическое изображение иммуноглобулина G. Тетрамер, состоящий из двух легких и двух тяжелых цепей, соединенных между собой –S-S- связями (обозначены линиями).
Оптическая плотность каждой ночной культуры бактерий была измерена 29 ноября, и смешана в пропорции 1 к 1, затем введена в растение. Плотность колоний составляла 0,31 вектора 11520 и 0,32 вектора 11333.
 | Рисунок 3. Схема инфильтрации смесью векторов 11520 и 11333 для продукции иммуноглобулина G. |
На рисунке 3 приведена схема инфильтраций для иммуноглобулина. Всего 6 листьев типа А и 4 листа типа Б. А (тип размещения инфильтрации); 1 (тип инфильтрации), 1 (номер растения). Пример обозначения пробы: А; 1 – 1
Через 6 полных суток, 5 декабря были собраны и заморожены пробы с листьев «А». Были подготовлены экстракты и заморожены. Ещё через 2 дня собрана первая часть проб с листьев «Б». Заморожена цельными высечками. На следующий день собрана вторая часть проб с листьев «Б». Пробы были собраны в разные дни, так как из-за малого количества бактерий в суспензии было не ясно, будет ли получен хороший результат, как в случае GFP, или будет ли он получен в принципе.
Для того, чтобы подготовить экстракт для анализа накопления иммуноглобулина необходимо:
-
растереть высечку из инфильтрированной зоны листа растения с целитом (абразивным порошком) -
добавить буфер 1×PBS (50 мкл) -
центрифугировать 10 минут при 14 тысячах оборотов -
перенести 50 мкл экстракта в пробирку с 25 мкл 4× буфера для нанесения, содержащего краситель, глицерин и детергент. -
прогреть пробы на 95° в течение 5 мин. После этого можно наносить пробы в гель или заморозить на -20°.
Подготовленные пробы были занесены в полиакриламидный гель (ПААГ). 23 декабря, для того чтобы определить количество иммуноглобулина. Т.к. на гель наносят маркёры (белки известной массы и подвижности, ориентируясь на положение которых можно оценить положение исследуемого белка в геле), а также экстракт из незараженного листа, то можно с уверенностью определить зону, соответствующую иммуноглобулину после электрофореза и окраски геля Кумасси.
Подготовка и проведение электрофореза в ПААГ:
-
Необходимо залить ПААГ между 2 специальными стёклами и дать ему время застыть. Использовали 7,5% гель, подходящий для анализа крупных белков. -
Когда ПААГ застынет, нужно промыть лунки для проб и внести сами пробы. -
В прибор можно поместить от одного до 4 гелей для одновременного проведения электрофореза, само разделение белков в геле происходит за счет воздействия электрического тока и наличия специального буфера для белкового электрофореза в приборе. -
Сила тока выставляется из расчета 10-15 мА на один гель. Процесс занимает примерно 1,5 часа. -
Когда электрофорез завершится, промыть гель и поместить в ёмкость с раствором красителя Кумасси в воде с добавлением этанола и уксусной кислоты. Происходит специфическое окрашивание белков и неспецифическое – самого геля. Для того чтобы удалить краску с геля, необходимо прокипятить гель в дистиллированной воде, сменив воду 2-3 раза. -
Отсканировать гель, переводя его в цифровое изображение. -
Выделить зону, соответствующую иммуноглобулину в программе ImageJ, провести расчет количества пикселей в выбранной зоне.
Фото ПААГ после электрофореза. Самые верхние полосы — иммуноглобулин (обозначены стрелкой).
Ниже представлена таблица значений иммуноглобулина в абсолютных значениях. Растения №1-3 не будут учитываться в дальнейших расчётах, так как дали отклоняющиеся от ожидания результаты, хотя другая половина растений дала логичные и ожидаемые.
| | 10 раз. | 100 раз. | 1000 раз. |
| Раст. № 1 | 2940 | 659 | 2595 |
| Раст. №2 | 2425 | 851 | 1772 |
| Раст. №3 | 768 | 110 | 1332 |
| Раст. № 4 | 3060 | 759 | 155 |
| Раст. № 5 | 5239 | 2517 | 490 |
| Раст. № 6 | 1667 | 751 | 278 |
Подобные результаты могли быть получены из-за того, что растения ранее использовались для других экспериментов в лаборатории, и с расположением места инфильтрации, так как в верхней части листа наработка белка всегда идёт лучше, чем в нижней. Результаты этих растений в таблицу включены не будут.
| | В 10 раз. | В 100 раз. | В 1000 раз |
| 4 | 19,74 | 4,90 | 1,00 |
| 5 | 10,69 | 5,14 | 1,00 |
| 6 | 6,00 | 2,70 | 1,00 |
| среднее | 12,14 | 4,24 | 1,00 |
Таблица в условных значениях.
Относительный уровень накопления иммуноглобулина.
Данные таблицы для растений 4 – 6 подтверждает предположение о том, что количество белка прямо пропорционально разведению агробактерии.
В итоге для производства целевого белка иммуноглобулина требуется большие концентрации агробактерии и больше времени, чем для GFP, причём разведение в 10000 не дало видимых результатов, так как концентрация бактерий слишком низкая. То, что высечки, собранные 7 декабря, были заморожены, не играет роли, т.к. собранные 8 декабря и замороженные уже экстрактом пробы также не дали результатов.