Добавлен: 22.11.2023
Просмотров: 157
Скачиваний: 6
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
эксплантатами, и впервые данная методика была использована Бенджаминсоном, Гилкристом и Лоренцом (Benjaminson, Gilchriest, Lorenz) [8]. Они в течение семи дней помещали эксплантаты скелетной мускулатуры золотой рыбки в разные питательные среды и наблюдали увеличение площади эксплантата на 5,2–13,8% (в случае с помещением в среду с диссоциированными клетками скелетной мускулатуры рыбки того же вида площадь и вовсе увеличивалась на 79%).
К сожалению, как можно понять из результатов их исследований, эксплантаты в питательных средах размножаются неохотно. Золотой серединой в данном случае выступают миосателлиты (клетки, каждая из которых по своей «производительности» эквивалентна 70 эмбриональным миобластам; рис. 2) и миобласты, так как они всё еще способны пролиферировать с необходимой скоростью и при этом уже в достаточной степени дифференцировались. Однако в 2012 году Марк Пост отметил, что выделение, культивирование и поддержание динамического пролиферативного состояния миосателлитных клеток возможно, но является сложной задачей. Отмечают также, что миоциты скелетной мышечной ткани могут быть успешно получены путем трансдифференцировки (перепрограммирования) из широко доступных жировых клеток [9].
Миосетеллиты на стадии пролиферации (рисунок)
После выделения необходимых для производства клеток к ним добавляют специальный раствор, известный как среда роста. Такие среды должны содержать необходимые питательные компоненты в такой форме, которая будет свободно доступной для миобластов и «сопутствующих» клеток. С этой целью проводят усовершенствования состава коммерчески доступных сред для культивирования клеток, что в свою очередь, повышает способность успешно культивировать многие типы клеток животных.
Чашка Петри с сывороткой для выращивания культуры клеток (рисунок)
Одна из наиболее доступных сред — фетальная бычья сыворотка, производимая из крови, взятой у крупного рогатого скота через закрытую систему сбора на бойне (рис. 4). Однако она всё еще имеет животное происхождение. От использования подобной среды в идеале надо постепенно отказываться, в связи с чем ведутся поиски различных альтернатив. К примеру, Макфарланд вместе со своими коллегами разработал бессывороточную среду, которая поддерживала размножение в культуре клеток-сателлитов индейки
[10]. Кроме того, существуют различные заменители сыворотки, являющиеся хорошей альтернативой фетальной бычьей сыворотке. Как пример можно привести Ultroser G — один из многих коммерчески доступных заменителей. Успешно использовали также бессывороточную среду, изготовленную из экстракта гриба майтаке, при этом скорость роста в ней была выше, чем при использовании фетальной бычьей сыворотки [8].
Фетальная бычья сыворотка – одна из наиболее распространенных сред роста.
Альтернативой сыворотке, по заявлению У.С. Аргравеса из Медицинского университета Южной Каролины, могут послужить липиды, такие как сфингозин-1-фосфат — они способны поддерживать рост и дифференциацию эксплантатов эмбриональной ткани [10]. В целом, идеальные питательные среды не должны содержать компонентов животного происхождения — преимущественно, по этическим соображениям, ведь в противном случае придется всё так же выращивать животных, но уже не на убой, а на получение сыворотки. Тем не менее если использовать белки растительного происхождения, необходимо устранить потенциальный риск возникновения аллергии на них.
Процесс разработки технологии производства культивируемого мяса сдерживается также проблемой проведения культивации в больших масштабах в отсутствии «живого» гомеостатического регулирования — то есть, когда в формировании мышечной ткани не принимают участия системы живого организма. Пока еще не созданы системы, способные точно повторить процесс гомеостатической регуляции. Миоциты при этом должны выращиваться в аэробных условиях, чтобы предотвратить подкисление культуральной среды молочной кислотой. Жизнеспособность клеток положительно коррелирует с градиентом кислорода в растущих культурах миоцитов, так что переносчики кислорода, вероятно, потребуются для поддержания концентрации кислорода на достаточно высоком уровне, чтобы предотвратить гипоксию и подкисление [11].
Однако для растущих мышечных клеток необходимо не только правильное питание, но и соответствующие факторы роста — полипептиды, поддерживающие различные терминальные фенотипы (физические характеристики животного или его ткани на конечной стадии развития) и регулирующие дифференцировку стволовых клеток и пролиферацию. Некоторые из них синтезируются и высвобождаются самими мышечными клетками, а в тканях также обеспечиваются другими типами клеток локально (паракринные) и нелокально (эндокринные). Печень является основным источником циркулирующего
инсулиноподобного фактора роста I. Теоретически можно разработать соответствующие системы совместной культуры, чтобы клетки печени (гепатоциты) обеспечивали факторы роста, необходимые для производства культивируемых мышц, то есть «мяса из пробирки». Как правило, исследователи вызывают дифференцировку и слияние миобластов путем снижения уровня митогенных факторов роста. После этого пролиферирующие клетки начинают синтез инсулиноподобного фактора роста II; клетки дифференцируются, и образуются многоядерные миотрубки. Также в качестве факторов роста могут использоваться трансформирующий фактор роста β, костные морфогенные белки и факторы роста фибробластов.
Исходя из этого, вытекает необходимость создания такой системы, в которой можно было бы изменять состав факторов роста в среде.
После снабжения питательными веществами клетки помещают в биореактор, где они способны удовлетворять свои энергетические потребности в приемлемой для роста среде. Для производства культивируемого мяса, скорее всего, потребуется разработка новых биореакторов, способных поддерживать низкую степень деформации в структуре вещества (так называемый «сдвиг») и равномерное распределение различных необходимых для роста веществ в больших объемах. Во многих исследованиях в области инженерии скелетных мышц использовали роторные (вращающиеся) биореакторы NASA. Главные их преимущества заключаются в том, что клетки почти непрерывно находятся в суспензии, «сдвиг» жидкости минимален, и суспензия позволяет культивирование тканей до 1 см. Эти биореакторы могут поддерживать концентрацию биомассы до 108 клеток/мл. Роторные биореакторы, использующиеся в исследованиях (размером от 10 до 250 мл), в последствии были увеличены в объеме до трех литров. Это позволило предположить, что теоретически масштабирование до промышленных размеров не должно влиять на физику системы. Промышленные масштабы уже доступны для биопленочных реакторов на основе частиц с малым «сдвигом» — это позволило достичь концентраций биомассы до 30 кг/м3.
Сейчас можно получить полосы мышечного волокна [12], но проект прототипа биореактора, пригодного для массового выращивания, еще не разработан, не говоря уже о модели, необходимой для полномасштабного производства
[11]. Как уже говорилось ранее, в идеале структура мышц требует чего-то похожего на систему кровообращения, служащую для доставки питательных веществ и кислорода к растущим клеткам или волокнам, а также для удаления продуктов обмена веществ. Подобные проекты для промышленного использования еще не были реализованы, хотя передовые технологии по производству биоматериалов вполне позволяют создание такого проекта[7].
Биореактор «Future meat»
Тем не менее ведутся работы по созданию новых типов биореакторов. В частности, в 2016 году Ю.А. Иванов (член-корреспондент РАН) и Е.Б. Петров (кандидат с.-х. наук, сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института механизации животноводства) в своей статье «Разработка биореактора для производства культурального мяса» описали созданный ими двухкамерный биореактор, позволяющий избежать гидроударов, кавитации, высокотурбулентных и застойных зон. Биореактор может работать в двух режимах — без перемешивания в камере роста и с перемешиванием, что потенциально делает его универсальным [15].
Для придания мясу объема необходима некая «основа» для его роста — своеобразные строительные леса, которые обеспечивают структуру и упорядоченность будущего стейка. В идеале подобный «каркас» должен быть съедобным, чтобы не пришлось потом удалять его из мяса. Также он должен смещаться (имитировать движение), чтобы растягивать развивающуюся мышцу, тем самым имитируя организм животного в период естественного развития мышечной ткани, а получение его должно быть возможным из материала «неживого» происхождения.Помимо этого, каркас должен быть гибким, чтобы не отделяться от развивающихся миотрубок (мышечных волокон на раннем этапе развития), подверженных спонтанному сокращению, которые затем дифференцируются в миофибриллы. Сократительные и другие типы белков в мышцах играют важную роль в формировании текстуры, цвета и вкуса культивируемой мышечной ткани. Например, гемоглобиновый белок миоглобин отвечает за красный цвет мяса и является важным источником железа в мясе [16]. В качестве оных каркасов используют либо коллагеновую сетку, либо шарики-микроносители (например, Cytodex-3 в роторных биореакторах). Однако все они имеют свои недостатки. Коллагеновая сетка (или шарики) позволяет вырастить слой миоцитов толщиной не более 100–200 мкм из-за ограничений диффузии
[17-19]. В принципе, эту проблему можно решить совмещением слоев или продуктов клеточной культуры, что позволит получить мышечный или мясной продукт приемлемого размера [12], [13]. Шарики-микроносители же не имеют растягивающего потенциала.
Пример каркаса для пролиферации – коллагеновая микросфера
Один из способов механического растяжения миобластов для их дифференцировки заключается в использовании съедобных, чувствительных к стимулам пористых микросфер, изготовленных из целлюлозы, альгината, хитозана или коллагена. Эти сферы могут подвергаться, как минимум, 10%-ному изменению площади поверхности после незначительных изменений температуры или pH среды. Подобный метод может послужить какой-никакой, а все же альтернативой сетке и микроносителям. В ходе исследований [20] было обнаружено, что гидрогель фибрина также является подходящим каркасом для тканей скелетных мышц, поскольку клетки могут мигрировать, пролиферировать и производить свой собственный внеклеточный матрикс.«Строительные леса» также должны предусматривать возможность развития кровеносных сосудов в культивируемой ткани для нормального ее развития. Создание каркаса, способного обеспечить васкуляризацию, представляет собой весьма сложную задачу. Существует несколько теоретических моделей для решения данной задачи. К примеру, была предложена модель построения разветвленной сети из пищевого, эластичного и пористого материала, через который питательные вещества могли бы перфузироваться (то есть проникать в ткани, омывая их). Миобласты и другие типы клеток затем «подключались» бы к этой сети. Один из способов формирования такой сети — создание отливки, на которую наносится раствор коллагена или биосовместимого полимера. После затвердевания исходный материал растворяется, оставляя разветвленную сеть микроканалов, которые могут накладываться друг на друга, образуя трехмерную сеть [21]. Однако такой способ не подходит для массового производства. Возможная альтернатива — создание мяса без «строительных лесов». Уже упомянутые Бенджаминсон, Гилкриест и Лоренц предложили решить проблему васкуляризации с помощью контролируемого ангиогенеза эксплантатов.
Стоит также учесть, что технология с использованием каркаса может быть применена только в случае культивирования мяса без костей или фарша. В конечном счете, мы получим мясо, которое можно использовать для гамбургеров или колбасы. Для создания же более структурированного мяса, к примеру, бифштекса, необходимо создать структурированную мышечную ткань как самоорганизующуюся конструкцию, либо же культивировать уже сформировавшуюся, полноценную мышечную ткань.
К сожалению, как можно понять из результатов их исследований, эксплантаты в питательных средах размножаются неохотно. Золотой серединой в данном случае выступают миосателлиты (клетки, каждая из которых по своей «производительности» эквивалентна 70 эмбриональным миобластам; рис. 2) и миобласты, так как они всё еще способны пролиферировать с необходимой скоростью и при этом уже в достаточной степени дифференцировались. Однако в 2012 году Марк Пост отметил, что выделение, культивирование и поддержание динамического пролиферативного состояния миосателлитных клеток возможно, но является сложной задачей. Отмечают также, что миоциты скелетной мышечной ткани могут быть успешно получены путем трансдифференцировки (перепрограммирования) из широко доступных жировых клеток [9].
Миосетеллиты на стадии пролиферации (рисунок)
Добавление среды и факторов роста
После выделения необходимых для производства клеток к ним добавляют специальный раствор, известный как среда роста. Такие среды должны содержать необходимые питательные компоненты в такой форме, которая будет свободно доступной для миобластов и «сопутствующих» клеток. С этой целью проводят усовершенствования состава коммерчески доступных сред для культивирования клеток, что в свою очередь, повышает способность успешно культивировать многие типы клеток животных.
Чашка Петри с сывороткой для выращивания культуры клеток (рисунок)
Одна из наиболее доступных сред — фетальная бычья сыворотка, производимая из крови, взятой у крупного рогатого скота через закрытую систему сбора на бойне (рис. 4). Однако она всё еще имеет животное происхождение. От использования подобной среды в идеале надо постепенно отказываться, в связи с чем ведутся поиски различных альтернатив. К примеру, Макфарланд вместе со своими коллегами разработал бессывороточную среду, которая поддерживала размножение в культуре клеток-сателлитов индейки
[10]. Кроме того, существуют различные заменители сыворотки, являющиеся хорошей альтернативой фетальной бычьей сыворотке. Как пример можно привести Ultroser G — один из многих коммерчески доступных заменителей. Успешно использовали также бессывороточную среду, изготовленную из экстракта гриба майтаке, при этом скорость роста в ней была выше, чем при использовании фетальной бычьей сыворотки [8].
Фетальная бычья сыворотка – одна из наиболее распространенных сред роста.
Альтернативой сыворотке, по заявлению У.С. Аргравеса из Медицинского университета Южной Каролины, могут послужить липиды, такие как сфингозин-1-фосфат — они способны поддерживать рост и дифференциацию эксплантатов эмбриональной ткани [10]. В целом, идеальные питательные среды не должны содержать компонентов животного происхождения — преимущественно, по этическим соображениям, ведь в противном случае придется всё так же выращивать животных, но уже не на убой, а на получение сыворотки. Тем не менее если использовать белки растительного происхождения, необходимо устранить потенциальный риск возникновения аллергии на них.
Процесс разработки технологии производства культивируемого мяса сдерживается также проблемой проведения культивации в больших масштабах в отсутствии «живого» гомеостатического регулирования — то есть, когда в формировании мышечной ткани не принимают участия системы живого организма. Пока еще не созданы системы, способные точно повторить процесс гомеостатической регуляции. Миоциты при этом должны выращиваться в аэробных условиях, чтобы предотвратить подкисление культуральной среды молочной кислотой. Жизнеспособность клеток положительно коррелирует с градиентом кислорода в растущих культурах миоцитов, так что переносчики кислорода, вероятно, потребуются для поддержания концентрации кислорода на достаточно высоком уровне, чтобы предотвратить гипоксию и подкисление [11].
Однако для растущих мышечных клеток необходимо не только правильное питание, но и соответствующие факторы роста — полипептиды, поддерживающие различные терминальные фенотипы (физические характеристики животного или его ткани на конечной стадии развития) и регулирующие дифференцировку стволовых клеток и пролиферацию. Некоторые из них синтезируются и высвобождаются самими мышечными клетками, а в тканях также обеспечиваются другими типами клеток локально (паракринные) и нелокально (эндокринные). Печень является основным источником циркулирующего
инсулиноподобного фактора роста I. Теоретически можно разработать соответствующие системы совместной культуры, чтобы клетки печени (гепатоциты) обеспечивали факторы роста, необходимые для производства культивируемых мышц, то есть «мяса из пробирки». Как правило, исследователи вызывают дифференцировку и слияние миобластов путем снижения уровня митогенных факторов роста. После этого пролиферирующие клетки начинают синтез инсулиноподобного фактора роста II; клетки дифференцируются, и образуются многоядерные миотрубки. Также в качестве факторов роста могут использоваться трансформирующий фактор роста β, костные морфогенные белки и факторы роста фибробластов.
Исходя из этого, вытекает необходимость создания такой системы, в которой можно было бы изменять состав факторов роста в среде.
Помещение в биореактор
После снабжения питательными веществами клетки помещают в биореактор, где они способны удовлетворять свои энергетические потребности в приемлемой для роста среде. Для производства культивируемого мяса, скорее всего, потребуется разработка новых биореакторов, способных поддерживать низкую степень деформации в структуре вещества (так называемый «сдвиг») и равномерное распределение различных необходимых для роста веществ в больших объемах. Во многих исследованиях в области инженерии скелетных мышц использовали роторные (вращающиеся) биореакторы NASA. Главные их преимущества заключаются в том, что клетки почти непрерывно находятся в суспензии, «сдвиг» жидкости минимален, и суспензия позволяет культивирование тканей до 1 см. Эти биореакторы могут поддерживать концентрацию биомассы до 108 клеток/мл. Роторные биореакторы, использующиеся в исследованиях (размером от 10 до 250 мл), в последствии были увеличены в объеме до трех литров. Это позволило предположить, что теоретически масштабирование до промышленных размеров не должно влиять на физику системы. Промышленные масштабы уже доступны для биопленочных реакторов на основе частиц с малым «сдвигом» — это позволило достичь концентраций биомассы до 30 кг/м3.
Сейчас можно получить полосы мышечного волокна [12], но проект прототипа биореактора, пригодного для массового выращивания, еще не разработан, не говоря уже о модели, необходимой для полномасштабного производства
[11]. Как уже говорилось ранее, в идеале структура мышц требует чего-то похожего на систему кровообращения, служащую для доставки питательных веществ и кислорода к растущим клеткам или волокнам, а также для удаления продуктов обмена веществ. Подобные проекты для промышленного использования еще не были реализованы, хотя передовые технологии по производству биоматериалов вполне позволяют создание такого проекта[7].
Биореактор «Future meat»Тем не менее ведутся работы по созданию новых типов биореакторов. В частности, в 2016 году Ю.А. Иванов (член-корреспондент РАН) и Е.Б. Петров (кандидат с.-х. наук, сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института механизации животноводства) в своей статье «Разработка биореактора для производства культурального мяса» описали созданный ими двухкамерный биореактор, позволяющий избежать гидроударов, кавитации, высокотурбулентных и застойных зон. Биореактор может работать в двух режимах — без перемешивания в камере роста и с перемешиванием, что потенциально делает его универсальным [15].
Использование каркасов для пролиферации
Для придания мясу объема необходима некая «основа» для его роста — своеобразные строительные леса, которые обеспечивают структуру и упорядоченность будущего стейка. В идеале подобный «каркас» должен быть съедобным, чтобы не пришлось потом удалять его из мяса. Также он должен смещаться (имитировать движение), чтобы растягивать развивающуюся мышцу, тем самым имитируя организм животного в период естественного развития мышечной ткани, а получение его должно быть возможным из материала «неживого» происхождения.Помимо этого, каркас должен быть гибким, чтобы не отделяться от развивающихся миотрубок (мышечных волокон на раннем этапе развития), подверженных спонтанному сокращению, которые затем дифференцируются в миофибриллы. Сократительные и другие типы белков в мышцах играют важную роль в формировании текстуры, цвета и вкуса культивируемой мышечной ткани. Например, гемоглобиновый белок миоглобин отвечает за красный цвет мяса и является важным источником железа в мясе [16]. В качестве оных каркасов используют либо коллагеновую сетку, либо шарики-микроносители (например, Cytodex-3 в роторных биореакторах). Однако все они имеют свои недостатки. Коллагеновая сетка (или шарики) позволяет вырастить слой миоцитов толщиной не более 100–200 мкм из-за ограничений диффузии
[17-19]. В принципе, эту проблему можно решить совмещением слоев или продуктов клеточной культуры, что позволит получить мышечный или мясной продукт приемлемого размера [12], [13]. Шарики-микроносители же не имеют растягивающего потенциала.
Пример каркаса для пролиферации – коллагеновая микросфера
Один из способов механического растяжения миобластов для их дифференцировки заключается в использовании съедобных, чувствительных к стимулам пористых микросфер, изготовленных из целлюлозы, альгината, хитозана или коллагена. Эти сферы могут подвергаться, как минимум, 10%-ному изменению площади поверхности после незначительных изменений температуры или pH среды. Подобный метод может послужить какой-никакой, а все же альтернативой сетке и микроносителям. В ходе исследований [20] было обнаружено, что гидрогель фибрина также является подходящим каркасом для тканей скелетных мышц, поскольку клетки могут мигрировать, пролиферировать и производить свой собственный внеклеточный матрикс.«Строительные леса» также должны предусматривать возможность развития кровеносных сосудов в культивируемой ткани для нормального ее развития. Создание каркаса, способного обеспечить васкуляризацию, представляет собой весьма сложную задачу. Существует несколько теоретических моделей для решения данной задачи. К примеру, была предложена модель построения разветвленной сети из пищевого, эластичного и пористого материала, через который питательные вещества могли бы перфузироваться (то есть проникать в ткани, омывая их). Миобласты и другие типы клеток затем «подключались» бы к этой сети. Один из способов формирования такой сети — создание отливки, на которую наносится раствор коллагена или биосовместимого полимера. После затвердевания исходный материал растворяется, оставляя разветвленную сеть микроканалов, которые могут накладываться друг на друга, образуя трехмерную сеть [21]. Однако такой способ не подходит для массового производства. Возможная альтернатива — создание мяса без «строительных лесов». Уже упомянутые Бенджаминсон, Гилкриест и Лоренц предложили решить проблему васкуляризации с помощью контролируемого ангиогенеза эксплантатов.
Стоит также учесть, что технология с использованием каркаса может быть применена только в случае культивирования мяса без костей или фарша. В конечном счете, мы получим мясо, которое можно использовать для гамбургеров или колбасы. Для создания же более структурированного мяса, к примеру, бифштекса, необходимо создать структурированную мышечную ткань как самоорганизующуюся конструкцию, либо же культивировать уже сформировавшуюся, полноценную мышечную ткань.