Файл: Тема 1 Введение в иммунологию как в науку. Иммунитет и классификация иммунитета.pdf

16 специфическим активным центром антитела (I стадия), осложняется далее образованием длинных цепей из чередующихся молекул антигена и антител, а также разветвлением этих цепей (II стадия).
Во II стадии реакции происходит образование решетки «антиген + антитело».
Необходимое условие для образования решетки — наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антитела. Существует несколько вариантов соединения молекул антител с молекулами антигена. Молекулы антигена представляют собой узлы решетки, а молекулы антител — связующие звенья. В зоне избытка антител часть антигенсвязывающих участков свободна и формирование комплекса приостанавливается. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител — это отсутствие свободных антиген и свободных антител в надосадочной жидкости после образования осадка. В зоне избытка антигена комплекс «антиген + антитело» растворяется, так как свободные и связанные в решетку молекулы антигена конкурируют между собой за двухвалентные молекулы антител, в результате чего решетка распадается на ряд растворимых комплексов. Окончательное формирование системы «антиген + антитело» протекает намного медленнее, чем I стадия реакции.
Это неспецифический процесс, в который могут включаться различные посторонние белки, захватывающиеся решетчатой структурой «антиген + антитело» и неспособные диффундировать сквозь узкие петли этой решетки в надосадочную жидкость.
Скорость образования решетки зависит от температуры, ионной силы раствора и других условий. Оптимальные условия для реакции «антиген + антитело» in vitro следующие: температура 0–37°С; ионная сила 0,005–0,1 и рН 6,4–8,6.
Механизм реакций преципитации и агглютинации, при которых иммунный комплекс выпадает в осадок, вполне объясняет теория решетки. В ходе реакции преципитации решетка формируется непосредственно в растворе, а при агглютинации бактериальных клеток решетка
«антиген + антитело» образуется на самих клетках. О характере соединения антигена с антителом судят, применяя различные методы. Метод изучения активного центра (метка по родству), основанный на реакции гаптена со специфическими антидетерминантами, выявляет пептидные цепи, участвующие в построении активного центра антител.
Методом рентгеноструктурного анализа была раскрыта структура активного центра антител.
При этом не было получено прямых данных, указывающих на изменение формы активного центра после присоединения к нему антигена. Электронная микроскопия — один из важнейших методов не только изучения общей конформации молекул иммуноглобулинов, но и исследований комплексов антител с антигенами. Этим методом было выяснено, что комплексы «антиген — антитело» имеют кольцеобразную, перекрывающуюся или решетчатую структуру.
Реакции взаимодействия «антиген — антитело».
Реакции между антигенами и антителами in vitro, имеющие диагностическое значение, называли серологическими (от лат. serum—сыворотка), так как источником антител служила сыворотка крови. При появлении методов иммунохимического анализа серологические реакции стали одними из широкого набора реакций, выявляющих механизмы взаимодействия между антигенами и антителами. Если на разных этапах развития иммунологии в качестве антител для постановки серологических реакций использовали только сыворотку крови, теперь благодаря разнообразным методам выделяют из нее высокоочищенные иммуноглобулины. Для индикации и количественной оценки того или иного вещества антигенной природы предложены способы получения высокоспецифичных (моноспецифичных) антител и высокочувствительные методы регистрации концентрации отдельных компонентов реакции «антиген — антитело». Это стало возможным в связи с разработкой способов конъюгирования антигенов и антител с флуоресцирующими красителями и ферментами, введения компонентов реакции
«антиген+антитело» на различных типах носителей. Достижения современной иммунохимии позволили проводить реакции «антиген + антитело» на уровне, который вряд ли можно назвать серологическим, хотя источником антител продолжает оставаться сыворотка крови. Понятие
«серологическая реакция» окончательно отпадает, когда речь заходит о взаимодействии антигена с моноклональными антителами, получаемыми благодаря разработке гибридомной техники, и когда реакция «антиген + антитело» протекает при аллергии. Антитела в зависимости от свойств

17 антигена и условий взаимодействия с ним обладают нейтрализующим, иммобилизирующим, коагулирующим (осаждающим) и лизирующим (растворяющим) действиями. Нейтрализующее действие проявляется в реакциях нейтрализации токсина антитоксином; иммобилизирующее — в иммобилизации некоторых микроорганизмов; коагулирующее — в реакциях агглютинации и преципитации; лизирующее — в реакциях лизиса и связывания комплемента. Каждая из разновидностей серологических реакций имеет свои варианты, а их постановка — различные модификации, поэтому методические подходы к проведению реакций между антигеном и антителом довольно разнообразны.
Реакция нейтрализации (РН). В ходе реакции нейтрализации специфические антитела нейтрализуют токсическое действие антигена, которое проявляется при попадании последнего в организм. Если антигеном служит микробный экзотоксин (дифтерийный, столбнячный, ботулинический и др.), то специфические антитела нейтрализуют его. В организме происходит нейтрализация только свободного, не связавшегося с клетками токсина. Обезвреживание токсина в ходе физико химической реакции нейтрализации происходит за счет связывания его свободных аминогрупп, что приводит к потере токсичности. Если антигеном служит вирусный материал, нейтрализующие антитела полностью подавляют специфическую активность вируса, выявляемую в различных клеточных культурах, куриных эмбрионах и на подопытных животных. Вирус перестает размножаться, теряет свою инфекционность.
Реакции агглютинации (РА). Различают прямую и непрямую, или пассивную, агглютинации.
В прямой в качестве антигена выступает сама микробная клетка или структурные компоненты ее поверхностной оболочки. Предел чувствительности реакции агглютинации микробов составляет
0,01 мкг азота белка антител в 1 мл.
Агглютинация обусловлена в большей степени особенностями строения клеточной оболочки и ее функциями, нежели свойствами агглютининов. Реакция агглютинации способствует расположение антигенных рецепторов клеточной поверхности в виде скоплений. При пассивной агглютинации растворимые антигены (белки, полисахариды и их комплексы микробного происхождения) соединяются с нерастворимым носителем, выполняющим исключительно индикаторную функцию. Носителями могут быть эритроциты, частицы латекса, полиакриламида, бентонита и др.
Связывание антигена с носителем происходит в результате адсорбции или химического взаимодействия. Микробные полисахариды, например, адсорбируются на нативных эритроцитах без какой-либо их предварительной обработки. Различные белки (в том числе микробные фрагменты) можно присоединить к эритроцитам, но только после обработки различными химическими веществами, обладающими дубильным действием, — танином, хромахлоридом, формальдегидом или бензидином. Такая обработка предотвращает разрушение эритроцитов, которое может произойти при непосредственном контакте с антигеном. При условии, если антиген, связанный с носителем, соответствует антителу, происходит агглютинация.
Реакция преципитации (РП). Реакция «антиген + антитело» представлена преципитацией.
Она основана на осаждении антигена из раствора специфическими антителами. Комплекс
«антиген + антитело» выпадает в осадок только при определенных соотношениях концентраций реагирующих молекул. Область этих соотношений, при которых в надосадочной жидкости после образования преципитата не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела, называется зоной эквивалентности. Вне данной зоны при избытке антител или антигена феномен преципитации не происходит, так как образуется растворимый комплекс «антиген + антитело».
Реакция преципитации менее чувствительна, чем реакция агглютинации. Существуют модификации реакции преципитации.
Самый простой способ постановки
—
кольцепреципитация, которую выполняют в пробирках путем наслаивания на иммунную сыворотку различных разведений прозрачного исследуемого антигена. На границе двух реагирующих систем через определенное время появляется опалесцирующее серо-белое кольцо преципитации. Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле
(иммунодиффузия по Ухтерлони). Принцип этого метода заключается в следующем: растворимые антигены и антитела вносят в лунки, вырезанные в геле на определенном расстоянии. Компоненты реакции диффундируют в слое агара навстречу друг другу, образуя в зоне контакта преципитат в

18 виде мутной видимой линии преципитации. Для более детальных иммунологических исследований применяют метод иммуноэлектрофореза, предложенный в 1953 г. П. Грабаром и К.
А.
Уильямсом.
Вначале осуществляют электрофоретическое разделение антигена, представляющего собой смесь белковых или других молекул в забуференном агаровом геле.
После разделения в канавку, которая идет в направлении миграции антигенных веществ, вносят преципитирующую сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и на месте их взаимодействия появляются дугообразные серо-белые линии преципитации.
По числу, положению и форме этих линий дают заключение о составе исходной смеси антигенов.
Реакция лизиса (РЛ). Лизирующее (растворяющее) действие антител наглядно проявляется в реакциях лизиса и связывания комплемента. В их основе лежит взаимодействие корпускулярных антигенов со специфическими антителами. Иммуноглобулины при содействии комплемента разрушают эритроциты, из которых выходит гемоглобин, и реагирующая смесь из мутной взвеси эритроцитов преобразуется в прозрачную красную жидкость, так называемую лаковую кровь.
Реакция названа реакцией гемолиза. Когда иммуноглобулины также при содействии комплемента разрушают оболочку бактериальной клетки, наблюдается лизис бактерий — бактериолизис.
Реакция связывания комплемента (РСК). Механизм действия наиболее сложный по сравнению с другими серологическими реакциями. В РСК участвуют две системы
«антиген+антитело». Для визуальной регистрации связывания комплемента основной системой
«антиген + антитело» в реакцию дополнительно вводят вторую, или индикаторную, систему, состоящую из взвеси эритроцитов и соответствующей антисыворотки (гемолитической
сыворотки). Если основной комплекс «антиген + антитело» связал на себе комплемент (в случае соответствия антигена антителу), то гемолиз отсутствует и РСК дает диагностически положительный ответ.
Если в основной системе антиген и антитело неспецифичны друг другу, то комплемент остается свободным и фиксируется на втором индикаторном комплексе, вызывая гемолиз эритроцитов, и РСК дает диагностически отрицательный ответ. По чувствительности РСК примерно соответствует реакции пассивной гемагглютинации.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). В основу данного метода положено взаимодействие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции (чаще антитело) обладает способностью к вторичной флуоресценции благодаря предварительному соединению с флуоресцентным красителем. Образовавшиеся таким образом иммунные комплексы становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами на темном фоне под флуоресцентным микроскопом. В качестве флуоресцентных красителей используют флуоресцеин, родамин, В- изотиоцианат, и другие, имеющие реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианат и др.), которые соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, не теряя при обработке флуорохромами специфического связывания с соответствующим антигеном.
Существует два флуоресцентных метода: прямой и непрямой. Прямой метод основан на непосредственном специфическом соединении антигена с мечеными антителами. Непрямой
метод — на поэтапном выявлении комплексов «антиген — антитело» с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена
(например, бактериальной клетки) со специфическими антителами
(иммуноглобулинами) иммунной сыворотки. Второй этап — в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антииммуноглобулином.
Обнаружение иммуноглобулинов иммунофлуоресцентным методом возможно, если антиген, использованный in vitro для образования антител, представляет собой растворимый белок. В этом случае он может быть конъюгирован с флуорохромом и в таком виде использоваться для обнаружения гомологичных антител.
Иммуноферментный анализ (ИФА). В основу данного метода положена конъюгация антитела или гаптена с ферментом, которая не приводит к утрате антителом или гаптеном специфичности, а ферментом — каталитической активности. Однако в составе комплекса
«антиген — антитело» конъюгаты гаптен-фермент или антитело-фермент теряют свою каталитическую активность.

19
В качестве фермента успешно применяют, в зависимости от модификации метода, либо пероксидазу, __галактозидазу, либо щелочную и кислую фосфатазы (реже ацетилхолин, глюкоамилазу). Используемый для маркировки антител фермент не должен присутствовать в исследуемых клетках, содержащих антиген. Иммуноферментные методы первоначально были разработаны для гистохимических исследований. Принцип иммуногистохимического анализа с использованием ферментов заключается в следующем: антитела, маркированные ферментом, соединяются со специфическим антигеном, фиксированным на твердом носителе (полистироловая пластина или другие непористые полимеры), образуя невидимый комплекс. Выявление иммунных комплексов, содержащих фермент, проводится с помощью цветной реакции, происходящей при добавлении ферментспецифического субстрата. Окрашенный комплекс «антиген — антитело» выявляется в световой или электронной микроскопии. В дальнейшем методы иммуноферментного анализа стали применять для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. Были созданы гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы, принципиально отличающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Гомогенный метод характеризуется протеканием реакции «антиген — антитело» в гомогенном растворе, и этап физического разделения реагентов и продуцентов реакции не обязателен. Твердофазные методы основаны на применении антител (или антигенов), иммобилизованных на нерастворимых носителях, гомогенные методы — на эффекте модуляции антителами активности фермента, связанного с антигеном. В основу гомогенных методов положен принцип конкурентного взаимодействия меченого и немеченого гаптена с активными центрами антител. Чем больше свободного гаптена введено в реакцию до прибавления меченого гаптена, тем меньшее количество последнего будет связано с антителами. Соответственно и ферментативная активность в растворе изменится незначительно. Наоборот, чем меньше свободного гаптена ввести в реакцию, тем большее количество ковалентного соединенного с ферментом гаптена уйдет в иммунный комплекс, а ферментативная активность растворе существенно понизится. Определение неизвестной концентрации гаптена в образце осуществляют по заранее выведенной калибровочной кривой, для построения которой устанавливают зависимость активности фермента в данной системе от стандартных концентраций свободного гаптена. В твердофазном иммуноферментном анализе наряду с конкурентными методами распространены подходы, основанные на последовательном взаимодействии фиксированных на носителе иммуноглобулинов с антигеном (или наоборот), а затем с иммуноферментным конъюгатом, представляющим собой меченные ферментом антитела против иммуноглобулинов (сэндвич_метод, от англ. sandwich —
бутерброд).
В радиоиммунологическом анализе (РИА) специфичность реакции «антиген — антитело» сочетается с высокой чувствительностью, обеспечиваемой применением радиоактивной метки, благодаря которой можно определить количество азота антител до 10–8 мг/мл. Для проведения анализа необходимо иметь антисыворотки и гомологичные антигены, маркированные каким-либо изотопом йода. Чувствительность метода существенно возрастает при использовании антител с низкой перекрестной реактивностью и антигенов с высокой удельной радиоактивностью. В основу радиоиммунологического анализа положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого немеченого и известного количества меченого антигена с активными центрами антител. При этом происходит вытеснение меченого антигена или гаптена из его комплекса с антителом вследствие последующего добавления больших концентраций немеченого антигена или гаптена той же специфичности. Реакция (при высоком разведении ингредиентов) подчиняется закону действующих масс: происходящее вытеснение пропорционально введенному количеству немеченого антигена или гаптена. Конкуренцию между определяемым и меченым антигенами можно оценить количественно с помощью радиометрии, предварительно отделив образовавшиеся иммунные комплексы от несвязавшегося меченого антигена. Концентрацию определяемого антигена рассчитывают, исходя из сравнения соотношений свободного и связанного меченых реагентов с соответствующим стандартом.

20