Файл: Ячмень Hordeum vulgare L.docx

вертикально и неплотно один к другому по нескольку штук в пластиковые емко-сти.Емкостипомещаливтермостатна12сутокпритемпературе21°С.Нарисун-ках 3, 4 изображен процесс проращивания контрольных образцов семян ячменя врулонахна 7и 12деньэксперимента соответственно.3) 4)Рисунок 3, 4 – Процесс проращивания ячменя в рулонах для оценки росто-выхпоказателей сортообразцов.Через 12 дней для проведения учета рулоны вынимали из сосудов и развер-тывали на столе, осторожно отделяя верхний слой бумаги,SL (длина побега) иRL (длина корня), (в см) измеряли вручную с помощью масштабированной ли-нейки. Свежий вес (FW) проростков регистрировали (г) с использованием чув-ствительных весов. Соотношение побегов к корням (SRR) было рассчитано какотношение SL к RL. Снижение SL, RL и FW было рассчитано следующим обра-зом:Такжебылрассчитаниндексзасухоустойчивости(DTI)дляSLиRL:Сравнение физиологических показателей проростков ячменя, обладающихразличной полевой засухоустойчивостью, показало, что образцы существенноразличаются по реакции на повышенное содержание хлорида натрия и осмотиче-ский стресс, вызванный полиэтиленгликолем. Это подтверждает возможностьизучения механизмов устойчивости к засолению и засухе за счет генотипическойизменчивостиобразцов.Способностьсемянпрорастатьявляетсякритическиммо-ментомдляполученияростковобладающихэнергиейроста.

2. Молекулярно – генетические методы исследования

   1. Выделение РНК из проростков ячменя

---

ДлявыделенияРНКизтканейячменяиспользовалинаборреагентов«РНКэкстран»(ООО«Синтол»)(рисунок6).Рисунок 6 – набор реагентов «РНК – экстран»Первыйэтап–лизис клеток.

1. 
   Образцы тканей помещали в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл и гомогенизировали.
   
2. 
   К полученному гомогенату добавляли 300 мкл лизирующего раствора, перемешивали содержимое пробирок на вортексе кратковременно, затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течении 10 минут.
   
3. 
   Центрифугировали смесь 10 минут при 12000 g и 2-8 °С. Отбирали супернатант и переносили его в новую пробирку 1,5 мл.
   

Второйэтап– разделениефаз.

1. 
   Добавляли в пробирки по 40 мкл осаждающего реагента 1 и переме- шивали встряхиванием на вортексе трижды по 15 секунд.
   
2. 
   Смесь инкубировали при комнатной температуре при комнатной тем- пературе в течении 10 минут.
   
3. 
   Центрифугировали сместь 15 мин при 12000 g и 4-8 °С. Отбирали верхнюю водную фазу и переносили ее в чистую пробирку 1,5 мл.
   

На7рисункеизображенпромежуточныйрезультатпослевторогоэтапавы-деленияРНКизпроростковячменя.Рисунок 7- Второй этап (разделение фаз) выделения РНКТретийэтап-осаждение РНК.

1. 
   К водной фазе добавить равный объем Осаждающего реагента 2.
   
2. 
   Перемешивали содержимое пробирок на вортекск и оставляли стоять при комнатной температуре 5-10 минут.
   
3. 
   Центрифугировали смесь 8 минут при 12000 g и 4-8 °С. Осторожно удаляли супернатант.
   

---

Четвертыйэтап –промывкаиосаждениеРНК.

1. 
   Добавляли 400 мкл промывочного раствора и перемешивали не- сколько раз переворачиванием.
   
2. 
   Центрифугировали 8 минут при 12000 g и 4-8°С. Осторожно удаляли супернатант.
   
3. 
   Открытые пробирки сушить на воздухе или при 37°С до видимого ис- чезновения капель влаги.
   
4. 
   Добавляли к осадку 40 мкл воды свободной от нуклеаз содержащей 0,5 ед/мкл ингибитора РНКаз. Перемешивали и оставляли стоять при комнатной температуре 5-10 минут для растворения РНК.
   

Полученныйраствор РНКхранилипри-20°С.На данный момент РНК выделено более чем из 50 сортов из 120 сортов вы-борки.

2. Проведение реакции обратной транскрипции

Для проведения реакции обратной транскрипции использовали «Набор ре-агентовдляпроведенияобратной транскрипции»(ООО«Синтол»).В отдельной чистой пробирки готовили реакционную смесь для исследуе-мых образцов. Полученную реакционную смесь перемешивали на микроцентри-фуге–встряхивателеи центрифугироваливтечениинескольких секунд.Отбирали необходимое число микропробирок объемом 0,2 мл для проведе-ния реакции ОТ. Готовую реакционную смесь вносили по 15 мкл в подготовлен-ные0,2пробирки,установленныевштативтипа«IsоFreeze».Затемвносиливпро-бирки исследуемые образцы, перемешивали на микроцентрифуге- встряхивателеи центрифугировали. Устанавливали пробирки в амплификатор и инкубировалипри температуре 40°С 40 минут. Для инактивации фермента пробирки нагревалидо92°С иинкубировали 3-5минут.ПолученнуюкДНКхранилипри -20°С.

3. ПЦР в реальном времени

Впоследниегодывсебольшемолекулярно-биологических

---

методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически в неограниченных количе- ствах.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (или количественная ПЦР, кПЦР, ПЦР-РВ, англ. Real-time PCR, qPCR) — лабораторный метод, осно- ванный на методе полимеразной цепной реакции, позволяющий определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество её копий. Количество амплифицированной ДНК измеряется после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток: зон- дов или интеркаляторов. Оценка может быть количественной (измерение количе- ства копий матрицы) и относительной (измерение относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов).

Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдаю- щихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это

позволило поднять данную область науки на качественно новый уровень. Внедре- ние полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление — ДНК-диагностику. Основные принципы полимеразной реакции и состав реакционной смеси для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году (Kleppe et al, 1971). Однако исследователями не была продемонстрирована главная черта ПЦР — экспоненциальное увеличение коли- чества копий фрагмента исходной ДНК.

Поскольку в ходе полимеразной цепной реакции происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать по- лученный фрагмент при помощи ряда методов, первым и наиболее часто исполь- зуемым из которых является метод электрофореза молекул ДНК в геле с окраши- ванием бромистым этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завер- шении не дает информации об эффективности процесса (если не использовать

---

специальную постановку эксперимента), снижая тем самым потенциальную ин-формативность ПЦР. Применение метода было ограничено задачами, в которыхбыло достаточно ответа «да»–«нет». В начале 90-х годов прошлого столетия ис-следователипредложилирегистрироватьнакоплениеДНКнепосредственновходеПЦР(Higuchietal,1992).КэтойидееихподтолкнуложеланиеиспользоватьметодПЦРдляколичественногоопределенияисходногочисламатриц,попавшихв реакционную пробирку. Несмотря на то, что ПЦР и ранее использовали для ко-личественного определения нуклеиновых кислот, изобретение ПЦР «в реальномвремени» существенно упрощало технику измерения и делало подход более точ-ным (Higuchi et al, 1993). С этого момента началось бурное развитие как прибор-ной,такиреагентнойбазыдлявыполненияПЦРсрегистрациейнакопленияпро-дуктов амплификации непосредственно в ходе реакции. Уже в середине 90-х го-довпоявилисьпервыедетектирующиеамплификаторы(термоциклеры),акнасто-ящему моменту их разнообразие перевалило за 30 (на рынке присутствует более10 компаний,промышленно выпускающихприборыданноготипа).В основе полимеразной цепной реакции лежит природная способность тер-мофильногоферментаДНК-зависимойTaq-ДНКполимеразыосуществлятькопи-рование одной из цепей ДНК, стартуя с короткой ДНК-затравки (прямого прай-мера),комплементарнойдругой цепи.Необходимымикомпонентамиреакционнойсмесиявляются(праймерыограничивают зону амплифицируемого участка ДНК - ампликон), смесь четырехДезоксинуклеозидтрифосфатов(являются«строительными»ампликона),атакжебуфер,содержащийионыдвухвалентногомагния.ПротеканиюПЦРспо-собствуетбыстроеиточноециклическоеизменениетемпературы

---