Добавлен: 30.11.2023
Просмотров: 39
Скачиваний: 3
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
вертикально и неплотно один к другому по нескольку штук в пластиковые емко- сти. Емкости помещали в термостат на 12 суток при температуре 21°С. На рисун- ках 3, 4 изображен процесс проращивания контрольных образцов семян ячменя в рулонах на 7 и 12 день эксперимента соответственно.3) 4)
Рисунок 3, 4 – Процесс проращивания ячменя в рулонах для оценки росто- вых показателей сортообразцов.
Через 12 дней для проведения учета рулоны вынимали из сосудов и развер- тывали на столе, осторожно отделяя верхний слой бумаги, SL (длина побега) и RL (длина корня), (в см) измеряли вручную с помощью масштабированной ли- нейки. Свежий вес (FW) проростков регистрировали (г) с использованием чув- ствительных весов. Соотношение побегов к корням (SRR) было рассчитано как отношение SL к RL. Снижение SL, RL и FW было рассчитано следующим обра- зом:
Также был рассчитан индекс засухоустойчивости (DTI) для SL и RL:
Сравнение физиологических показателей проростков ячменя, обладающих различной полевой засухоустойчивостью, показало, что образцы существенно различаются по реакции на повышенное содержание хлорида натрия и осмотиче- ский стресс, вызванный полиэтиленгликолем. Это подтверждает возможность изучения механизмов устойчивости к засолению и засухе за счет генотипической изменчивости образцов. Способность семян прорастать является критическим мо- ментом для получения ростков обладающих энергией роста.
-
Молекулярно – генетические методы исследования
-
Выделение РНК из проростков ячменя
-
Для выделения РНК из тканей ячменя использовали набор реагентов «РНК экстран» (ООО «Синтол») (рисунок 6).Рисунок 6 – набор реагентов «РНК – экстран» Первый этап – лизис клеток.
-
Образцы тканей помещали в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл и гомогенизировали. -
К полученному гомогенату добавляли 300 мкл лизирующего раствора, перемешивали содержимое пробирок на вортексе кратковременно, затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течении 10 минут. -
Центрифугировали смесь 10 минут при 12000 g и 2-8 °С. Отбирали супернатант и переносили его в новую пробирку 1,5 мл.
Второй этап – разделение фаз.
-
Добавляли в пробирки по 40 мкл осаждающего реагента 1 и переме- шивали встряхиванием на вортексе трижды по 15 секунд. -
Смесь инкубировали при комнатной температуре при комнатной тем- пературе в течении 10 минут. -
Центрифугировали сместь 15 мин при 12000 g и 4-8 °С. Отбирали верхнюю водную фазу и переносили ее в чистую пробирку 1,5 мл.
На 7 рисунке изображен промежуточный результат после второго этапа вы- деления РНК из проростков ячменя.
Рисунок 7- Второй этап (разделение фаз) выделения РНК Третий этап - осаждение РНК.
-
К водной фазе добавить равный объем Осаждающего реагента 2. -
Перемешивали содержимое пробирок на вортекск и оставляли стоять при комнатной температуре 5-10 минут. -
Центрифугировали смесь 8 минут при 12000 g и 4-8 °С. Осторожно удаляли супернатант.
Четвертый этап – промывка и осаждение РНК.
-
Добавляли 400 мкл промывочного раствора и перемешивали не- сколько раз переворачиванием. -
Центрифугировали 8 минут при 12000 g и 4-8°С. Осторожно удаляли супернатант. -
Открытые пробирки сушить на воздухе или при 37°С до видимого ис- чезновения капель влаги. -
Добавляли к осадку 40 мкл воды свободной от нуклеаз содержащей 0,5 ед/мкл ингибитора РНКаз. Перемешивали и оставляли стоять при комнатной температуре 5-10 минут для растворения РНК.
Полученный раствор РНК хранили при -20°С.
На данный момент РНК выделено более чем из 50 сортов из 120 сортов вы- борки.
-
Проведение реакции обратной транскрипции
Для проведения реакции обратной транскрипции использовали «Набор ре- агентов для проведения обратной транскрипции» (ООО «Синтол»).
В отдельной чистой пробирки готовили реакционную смесь для исследуе- мых образцов. Полученную реакционную смесь перемешивали на микроцентри- фуге – встряхивателе и центрифугировали в течении нескольких секунд.
Отбирали необходимое число микропробирок объемом 0,2 мл для проведе- ния реакции ОТ. Готовую реакционную смесь вносили по 15 мкл в подготовлен- ные 0,2 пробирки, установленные в штатив типа «IsоFreeze». Затем вносили в про- бирки исследуемые образцы, перемешивали на микроцентрифуге- встряхивателе и центрифугировали. Устанавливали пробирки в амплификатор и инкубировали при температуре 40°С 40 минут. Для инактивации фермента пробирки нагревали до 92°С и инкубировали 3-5 минут.
Полученную кДНК хранили при -20°С.
-
ПЦР в реальном времени
В последние годы все больше молекулярно-биологических
методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически в неограниченных количе- ствах.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени (или количественная ПЦР, кПЦР, ПЦР-РВ, англ. Real-time PCR, qPCR) — лабораторный метод, осно- ванный на методе полимеразной цепной реакции, позволяющий определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество её копий. Количество амплифицированной ДНК измеряется после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток: зон- дов или интеркаляторов. Оценка может быть количественной (измерение количе- ства копий матрицы) и относительной (измерение относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов).
Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдаю- щихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это
позволило поднять данную область науки на качественно новый уровень. Внедре- ние полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление — ДНК-диагностику. Основные принципы полимеразной реакции и состав реакционной смеси для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году (Kleppe et al, 1971). Однако исследователями не была продемонстрирована главная черта ПЦР — экспоненциальное увеличение коли- чества копий фрагмента исходной ДНК.
Поскольку в ходе полимеразной цепной реакции происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать по- лученный фрагмент при помощи ряда методов, первым и наиболее часто исполь- зуемым из которых является метод электрофореза молекул ДНК в геле с окраши- ванием бромистым этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завер- шении не дает информации об эффективности процесса (если не использовать
специальную постановку эксперимента), снижая тем самым потенциальную ин- формативность ПЦР. Применение метода было ограничено задачами, в которых было достаточно ответа «да»–«нет». В начале 90-х годов прошлого столетия ис- следователи предложили регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР (Higuchi et al, 1992). К этой идее их подтолкнуло желание использовать метод ПЦР для количественного определения исходного числа матриц, попавших в реакционную пробирку. Несмотря на то, что ПЦР и ранее использовали для ко- личественного определения нуклеиновых кислот, изобретение ПЦР «в реальном времени» существенно упрощало технику измерения и делало подход более точ- ным (Higuchi et al, 1993). С этого момента началось бурное развитие как прибор- ной, так и реагентной базы для выполнения ПЦР с регистрацией накопления про- дуктов амплификации непосредственно в ходе реакции. Уже в середине 90-х го- дов появились первые детектирующие амплификаторы (термоциклеры), а к насто- ящему моменту их разнообразие перевалило за 30 (на рынке присутствует более 10 компаний, промышленно выпускающих приборы данного типа).
В основе полимеразной цепной реакции лежит природная способность тер- мофильного фермента ДНК-зависимой Taq-ДНК полимеразы осуществлять копи- рование одной из цепей ДНК, стартуя с короткой ДНК-затравки (прямого прай- мера), комплементарной другой цепи.
Необходимыми компонентами реакционной смеси являются (праймеры ограничивают зону амплифицируемого участка ДНК - ампликон), смесь четырех Дезоксинуклеозидтрифосфатов (являются «строительными» ампликона), а также буфер, содержащий ионы двухвалентного магния. Протеканию ПЦР спо- собствует быстрое и точное циклическое изменение температуры