Файл: азастан Республикасыны Білім жне ылым министрлігі лФараби атындаы аза лтты университеті байкенова аерке айратызы.docx
Добавлен: 07.12.2023
Просмотров: 84
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
(*М.А.Эльдаров және т.б. авторлар еңбегінен алынған)
Шарап штамдарының биохимиялық ерекшеліктері. Шарап ашыту процесі әртүрлі стресс түрлерімен - қанттың жоғары концентрациясымен, қоршаған ортаның қышқылдануымен байланысты кернеулермен, сульфиттердің жоғары мөлшерімен, анаэробты жағдайлармен, азот көздерінің, липидтердің, витаминдердің жетіспеушілігімен, жоғары концентрациямен анықталатын осмостық кернеумен бірге жүреді [46]. Жақсы шарап штаммдары шарап ашытудың барлық негізгі фазаларында осы абиотикалық факторлардың бірлескен әсеріне төзімді және басқа да бірқатар маңызды технологиялық сипаттамаларға ие болуы керек (2-кесте).
Кесте 2 - Шарап штаммдарының негізгі өндірістік сипаттамалары
(*М.А.Эльдаров және т.б. авторлар еңбегінен алынған)
| «Ашыту» сипаттамалары | Технологиялық сипаттамалары |
| Ашытудың тез басталуы | Генетикалық тұрақтылық |
| Жоғары ашыту тиімділігі | Сульфитке жоғары төзімділік |
| Этанолға жоғары төзімділік | Көбіктенудің аз болуы |
| Жоғары осмостық тұрақтылық | Флокуляцияға қабілеттілік |
| Төмен температуралық оптимум | Тұнбаның аз түзілуі |
| Биомасса санының көптігі | Кептіруге төзімді |
| Протеолитикалық белсенділік | |
| Азотты аз мөлшерде қажет етуі | |
| Шараптың хош иісі мен букетіне әсер ететін сипаттамалары | Зат алмасу ерекшеліктеріне сипаттамалары |
| Төмен сульфид пен тиолдың төмен мөлшері | Биогенді аминдердің төмен деңгейі |
| Ұшқыш қышқылдардың аз өндірілуі | Этил карбаматтың төмен деңгейі |
| Жоғары спирттердің төмен деңгейі | |
| Глицериннің жоғары деңгейі | |
| Жоғары эстеразды белсенділік |
Шараптың сенсорлық және органолептикалық қасиеттері үшін қанттың, аминқышқылдарының, майлардың ыдырауы нәтижесінде түзілетін көптеген ашыту қосалқы өнімдерінің – глицерин, карбон қышқылдары, альдегидтер, жоғары спирттер, эфир және күкірт қосылыстары және т.б. Жүзімнің қышқылдары, терпендері мен тиолдары да өте маңызды, бұл көбінесе қолданылатын штамдардың сипаттамаларына байланысты. Ашыту нәтижесі көптеген факторларға, атап айтқанда, жүзім шырынының құрамы мен сапасына байланысты. Бұл негізінен қанттар (эквимолярлы жоғары концентрациядағы глюкоза және фруктоза, 180–300 г/л), органикалық қышқылдар (тартар және алма), бейорганикалық катиондар (калий), азотты қосылыстар және липидтер (фитостеролдар). Фруктозаның метаболизмі глюкозаға бағынатындықтан ашытудың кейінгі кезеңдерінде салыстырмалы фруктозаның мөлшері маңызды болып саналады. Шарап ашытқысы бұл қантты ұзақ аштық кезеңдерінде және этанолдың жоғары концентрациясы жағдайында ашытуы керек. Шарап штамдарының фруктозаны тиімді ашыту қабілеті спиртті ашытудың кеш сатысында жоғары ашыту жылдамдығын сақтау үшін өте маңызды. Азот - ашыту жылдамдығына және ұшпа мазмұнына әсер ететін тағы бір маңызды қоректік зат. Сусланың құрамы азотпен шектелген, ал азоттың жетіспеушілігі баяу немесе «жабысып қалған» ашытудың ең көп тараған себебі болып табылады. Ашытқылар үшін азот көздері аммоний иондары, аминқышқылдары, олигопептидтер, белоктар, амидтер, биогенді аминдер және нуклеин қышқылдары болуы мүмкін. 200 г/л қантты ашыту үшін 140 мг/л азот көзі қажет деп жалпы қабылданған. Жүзімнің көптеген басқа компоненттері ашытқылардың метаболизміне әсер етеді (мысалы, липидтер, витаминдер, әртүрлі ингибиторлар) [47-50].
1.3 Шарап ашытқыларының молекулалық-генетикалық ерекшеліктері
Ашытқыларды шарап жасауда және дәстүрлі биотехнологияның басқа салаларында кеңінен қолдану бұл микроорганизмдерді генетика, биохимия, жасуша биологиясы, физиология, геномика және эволюциялық биологиядағы зерттеулердің алдыңғы қатарына шығарды. Тіпті «геномға дейінгі» кезеңнің өзінде сахаромицеттердің табиғи және өндірістік штамдары жоғары генетикалық әртүрлілікпен сипатталатыны белгілі болды, бұл олардың S288C эталондық зертханалық штаммымен салыстырғанда олардың сипаттамаларында айтарлықтай айырмашылыққа әкеледі. Ашытқылардың «қол жетімді» штаммдарды алу кезінде адамдар абайсызда S. cerevisiae геномына енгізген эволюциялық шектеулер нақты қолдану үшін ең қолайлы жоғары мамандандырылған фенотиптері бар штаммдардың айтарлықтай санын өндіруге әкелді. S288C штаммының геномының шифры ашылғаннан бері өткен 20 жыл ішінде толық немесе ішінара дерлік геномдық реттілігі алынған S. cerevisiae штаммдарының саны бірнеше жүзге жетті. Бұл зерттеулердің барысы салыстырмалы түрде шағын геном өлшеміне және қайталану санының аздығына байланысты ашытқы мінсіз нысана болып табылатын жоғары өнімді секвенирлеу әдістеріндегі соңғы революциямен байланысты [51, 52].
Қазіргі уақытта NCBI дерекқорында әртүрлі S. cerevisiae изоляттарының 237 дерлік толығымен декодталған және аннотацияланған геномдары туралы ақпарат бар.
Saccharomyces cerevisiae шарап ашытқыларының штаммдарын адамдар қанттың жоғары жеміс шырындарының жылдам өсуі, жоғары өнімділік және этанолға және соңғы кезде сульфитке төзімділігі сияқты бірнеше арнайы белгілерге қарай эволюцияға қолайлы жағдайларда 8000 жылдан астам уақыт бойы таңдап алған.Шарап ашытқылары зертханалық штаммдарға қарағанда хромосомалардың мөлшері мен саны бойынша үлкен әртүрлілікті көрсетеді. Олар анеуплоидты, дисомиясы немесе трисомиялары бар, ал кейбір жағдайларда дерлік диплоидты немесе триплоидты. Анеуплоидия пайдалы гендердің көшірме санын көбейту және өлімге әкелетін немесе зиянды мутациялардан қорғау арқылы селективті артықшылықтар беруі мүмкін [53].
Анеуплоидия немесе полиплоидияның кең таралғаны сонша, хромосомалардың теңгерімсіз жиынтығын сақтау тиімді болып саналады. Хромосомалық өзгерістерге хромосомалардың көбеюі немесе жоғалуы, жойылуы (30–50 кб), гибридті хромосомалардың болуы және көп жағдайда қайталануы (30–390 кб) жатады. Бұл қайта құрулар субтеломерлі қайталанулар және транспозициялық элементтер арқылы рекомбинация арқылы пайда болды деп болжанған. Нүктелік мутациялар сияқты шамалы айырмашылықтар да мүмкін. Мұндай вариациялар штамм сипаттамаларына егер ол ашық оқу шеңберінде (ORF) немесе геннің реттеуші аймақтарында локализацияланған болса әсер етуі мүмкін [54, 55].
Кесте 3 - S. cerevisiae геномының тізбектік құрамы
| Кодталған өнімдер | Тізбектің жалпы саны | Тізбектің орташа мөлшері | Тізбектің геномдағы мөлшерінің пайыздық көрсеткіші (%) |
| Ақуыздар | |||
| Жалпы ОРС (САР) | 6340 | 1450 | 68,64 |
| Интрондар | 225 | 500 | 0,84 |
| РНК | |||
| рРНК | 140 | 9000 | 9,41 |
| тРНК | 275 | 80 | 0,16 |
| мяРНК | 80 | 500 | 0,30 |
| Мобильді элементтер | |||
| Ту1 – Ту5 | 53 | 5900 | 2,20 |
| Хросомалық элементтер | |||
| ARS | 750 | 20 | 0.11 |
| CEN | 16 | 95 | 0.01 |
| Субтеломерлі қайталама | |||
| (Y’) типі | 21 | 5800 | 0,92 |
| (Х) типі | 31 | 400 | 0,09 |
| Теломерлі қайталама (С1-3А) | 32 | 300 | 0,07 |
| Генаралық аудандар | 4600 | 500 | 17,25 |
(Saccharomyces геномы туралы ақпарат NCBI деректер базасынан алынған)
Ашытқы геномдарының өзгергіштігінің механизмі. Шарап штаммдарының және басқа ашытқы штаммдарының геномдарын ашу нәтижелері олардың маңызды генетикалық гетерогенділігі, көптеген SNP және InDels бар болуы, анықтамалық геноммен салыстырғанда үлкен хромосомалық қайта құрулар және CNV, ORF өлшемдеріндегі өзгерістер туралы «геномға дейінгі» идеяларды растады. 100 табиғи, клиникалық және өнеркәсіптік изоляттардың геномдық ретін S288C штаммының геномымен салыстыру SNP орташа жиілігі бір геномға 78140, Indel – 7840; 566 ORF үшін олардың өлшемдерінде ауытқулар табылғанын көрсетті. 236 штамм үшін анықталған шарап ашытқысының геномдарының нуклеотидтер тізбегінің өзгергіштік дәрежесі айтарлықтай төмен болып шықты, бұл штаммдардың жоғары инбредтелген популяцияны білдіретінін көрсетеді. Дегенмен, шарап ашытқысы штамдарының геномдарында хромосомалық полиморфизмдердің барлық түрлерінің мысалдарын, сондай-ақ айқын адаптивті маңызы бар интрогрессия мен HGT іздерін табуға болады [56, 57].
Транслокация және амплификациясы. Ашытқылардағы хромосомалық полиморфизмнің негізгі себебі Тu элементтері мен басқа қайталанулар арасындағы эктопиялық рекомбинация болып табылады. Транскрипция мен трансляцияны реттеу факторларын және әртүрлі адгезиндерді кодтайтын иондарды, қанттарды және металдарды тасымалдауға жауап беретін субтеломерлі аймақтарда орналасқан гендер көбіне делециялар мен амплификацияларға ұшырайды. Бұл бақылаулар субтеломерлік аймақтардың жоғары пластикасын және олардың шарап ашытқыларының өзгермелі қоршаған орта жағдайларына тез бейімделуі үшін өзгергіштік көзі ретіндегі маңызды рөлін растайды. Шарап штамдарындағы хромосомалық қайта құрылымдау жиілігінің жоғарылауы этанолдың жоғары концентрациясының мутагендік әсерімен байланысты болуы мүмкін, дегенмен бұл вариациялардың адаптивті маңызы анық емес. Бейімделу мәні бар хромосомалық қайта құрылымдаудың жақсы құжатталған мысалы шарап штамдарындағы VIII және XVI хромосомалар арасындағы жалпы реципрокты транслокация болып табылады. Бұл транслокация SSU1-R1 сульфитті сорғы генінің басым аллельінің түзілуіне әкелді. Бұл аллельдің экспрессия деңгейі бастапқы SSU1 генінен әлдеқайда жоғары, осылайша тасымалдаушы штаммдарда сульфитке төзімділіктің жоғары деңгейін қамтамасыз етеді. Жақында XV және XVI хромосомалары арасындағы тағы бір транслокация табылды, бұл да SSU1 генінің экспрессиясының жоғарылауына әкеледі. Бұл екі транслокация шарап ашытқыларында ғана табылды, олар жоғары жиілікте жүреді және сульфиті бар ортада лаг фазасының ұзақтығын қысқарту арқылы селективті артықшылық береді. Осылайша, сульфитті қолданудың ғасырлар бойы тәжірибесі SSU1 аллельінің химерикалық нұсқасы бар штаммдарға бейімделу артықшылығын беретін конвергентті эволюциялық қайта құруларды алға жылжытатын «көпірді» тудыруы мүмкін [58, 59].
Адаптивті құндылығы бар қолға үйретудің тағы бір мысалы CuSO4-ке жоғары төзімділікті алу болып табылады. Мыс сульфаты жүзімдіктерді ұнтақты көгеруден қорғау үшін фунгицид ретінде кеңінен қолданылады. Еуропалық және жапондық желілердің штаммдарында бұл төзімділік мыс байланыстыратын металлотионеин ақуызын кодтайтын CUP1 генінің көшірме санының жоғарылауымен байланысты. Промотордың нуклеотидтер тізбегінің өзгеруі EC1118 штаммында табылған CUP1 генінің экспрессиясын күшейтудің тағы бір жолы болып табылады [60].
Жақында жүргізілген геномдық зерттеулер адаптивті маңызы бар CNV шарап штаммдарының айтарлықтай санын анықтады (М.А.Елдаров т.б. авторлар). Көбінесе әртүрлі цитотоксикалық агенттерге ашытқы төзімділігін қамтамасыз ететін тасымалдаушылардың, дегидрогеназалардың және басқа белоктардың гендері күшейтуге ұшырайды.
Гендердің жоғалуы және инактивациялануы.Суды тасымалдаушылар, Aqy аквапориндер суды экспорттау арқылы мұз кристалдары арқылы жасушаішілік зақымдануды болдырмайтын мұздату-еріту стрессінде өмір сүру үшін өте маңызды. Екінші жағынан, осмостық кернеуді жеңу үшін жоғары қант субстраттары пайдаланылған кезде Aqy функцияларын жоғалту пайдалы. Зертханалық және өндірістік штаммдар, сондай-ақ кейбір табиғи штамдар функционалды емес AQY2 немесе AQY1 аллельдерін алып жүреді. Бұл паралогтардың мутациялық инактивациясы бірнеше рет орын алды [61].
Гендердің көлденең трансфері. Салыстырмалы геномика әдістері HGT шарап ашытқыларының геномдық ландшафтына күтпеген елеулі үлесін анықтады. EC118 коммерциялық штаммының геномында филогенетикалық алыс ашытқы штаммдарынан тәуелсіз HGT оқиғалары нәтижесінде алынған үш хромосомалық сегменттер, A, B және C табылды. В учаскесінің доноры ашытқы Zygosaccharomyces bailii ашытқысы болды, ашыған шараптың жиі ластаушы заты. B сайтының нұсқаларының көп көшірмелері әртүрлі шарап штаммдарында табылды. С сайтының шығу тегі Torulaspora microellipsoides ашытқысынан салыстырмалы түрде жақында жүргізілген зерттеулермен байланысты. Барлық үш сегменттің бір бөлігі ретінде барлығы түсіндіріледі
Шарап жасау үшін, атап айтқанда, азот пен көміртек катаболизмі үшін потенциалды маңызды функциялары бар 39 ген бар. С локусының кейбір гендері толығырақ сипатталған. Осылайша, FSY1 гені жоғары жақындығы бар фруктозаның Н+ симпортерін кодтайды, оның болуы фруктозаның мөлшері жоғары болған кезде ашытудың кеш кезеңдерінде маңызды болуы мүмкін. Ксилозаны пайдалану үшін ксилитдегидрогеназа XDH1 гені қажет [62].
Тандемді дубликацияланған FOT1-2 гендер олигопептидті тасымалдаушыларды кодтайды және бұл гендердің бейімделу маңыздылығы эксперименталды түрде дәлелденді. Fot протеиндерінің экспрессиясының жоғарылауы бар штамдар олигопептидтердің үлкен жиынтығын, әсіресе глутаматқа олигопептидтерді тасымалдауды қамтамасыз етті, бұл шарап жасау жағдайында өсу жылдамдығының, ашыту тиімділігінің және өміршеңдігін арттыруға әкелді. Сонымен қатар, Fot пептидті тасымалдау көміртегі мен азот алмасуының орталық жолдарына, аминқышқылдары мен пептидтердің синтезіне, тотығу стрессіне реакцияға, тотығу-тотықсыздану метаболизміне айтарлықтай әсер етті, бұл өз кезегінде шараптың органолептикалық қасиеттеріне оң әсер ететін эфирлердің мөлшерінің көбеюіне әкелді [63].
Түрлі ди- және трипептидтерді пайдалану мүмкіндігі штаммдар арасында айтарлықтай өзгерісті тудырады және FOT гендерінің болуы осы фенотиптік өзгергіштікке маңызды үлес қосады. Азот катаболизмінің тиімділігін арттыруда маңызды рөлді FOT гендерімен бірге HGT арқылы тасымалданатын осы жаңа локустардың бөлігі болып табылатын басқа гендер де атқара алады. Олардың ішінде аспарагиназаны, оксопролиназаны, аммиак тасымалдаушыларын кодтайтын гендер, лизин гендерінің транскрипция факторлары және пролинді утилизациялау ферменттері бар.
Интрогрессия. S. cerevisiae шарап штаммдарында S. paradoxus, S. uvarum және S. eubayanus штаммдарынан интрогрессияның бірнеше орындары (яғни, тектегі HGT) анықталды. Коммерциялық шарап штаммдарына ауыстырылған S. paradoxus геномының кеңейтілген аймағы ақ шарап өндіру технологиясы үшін маңызды болып табылатын SUC2 инвертаза генінің және глюкан альфа 1,4 глюкозидаза генінің аймағын қамтиды. Тасымалданған локуста сонымен қатар штаммдарға тән және жасуша бетіне гидрофобтылық беретін AWA1 гені бар. Соңғы зерттеулердің бірі түр аралық будандастырудың эволюциялық артықшылықтарын эксперименталды тексеруге арналған. Эксперименттік гибридті S. cerevisiae мен S. uvarum алынды және азоттық ашығу жағдайында тәжірибелік іріктеуден өтті. Нәтижесінде жоғары аффинді аммоний өткізгіштігін кодтайтын модификацияланған химерлі MEP2 гені бар штамм таңдалды. Бұл S. uvarum геномының шағын аймағының S. cerevisiae XIV хромосомасына енуінің нәтижесінде орын алды [64].
Сахаромицеттердің түр аралық будандары сыра қайнату және шарап жасауда кеңінен қолданылады. Ең танымал мысал - S. pastorianus ашытқысы.
Кейбір коммерциялық шарап штаммдары да гибридтер мен полиплоидтар болып табылады - VIN7