Файл: Общая характеристика биотехнологического процесса.docx

Одноступенчатые БТ процессы - это процессы, при проведении которых получают целевой продукт непосредственно из биообъекта.

Двухступенчатые БТ процессы - это постепенное наращивание биообъекта в возрастающем количестве на питательной среде и перенос его в другой биореактор для биосинтеза целевого продукта.

Многоступенчатые БТ процессы - это процессы генной инженерии, связанные с конструированием биообъекта и использованием его в дальнейшем как продуцента БАВ (биологически активные вещества)

3. Основные технологические стадии биотехнологического процесса

Промышленный биотехнологический процесс, в котором для производства коммерческих продуктов используются микроорганизмы, обычно состоят из трех ключевых этапов:

1. Исходная обработка: обработка сырья для использования в качестве источника питательных веществ для микроорганизма-мишени.

2. Ферментация и биотрансформация: рост микроорганизма-мишени в большом (обычно более 100 л) биореакторе (ферментация) с последующим образованием нужного метаболита, например антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформация).

3. Конечная обработка: очистка целевого продукта от компонентов культуральной среды или от клеточной массы.

Цель биотехнологических исследований – максимальное повышение эффективности каждого из этих этапов и поиск микроорганизмов, с помощью которых можно получить целевой продукт.

Наиболее трудным для оптимизации был этап биотрансформации. При использовании природных микробных штаммов выход конечного продукта часто оказывался существенно ниже оптимального. Традиционные схемы генетического усовершенствования бактерий включают скрининг, отбор и тестирование огромного количества колоний. Такие работы высокозатратны, занимают много времени и при этом можно рассчитывать только на усовершенствование уже существующих, передаваемых по наследству свойств штамма, а не на расширение его генетических возможностей. И все же к концу 70-х таким образом были усовершенствованы производственные процессы получения целевого ряда конечных продуктов.

К определяющим факторам биотехнологического процесса относят:

– вид используемого биотехнологического процесса;

– субстрат с его биохимическими и биофизическими характеристиками;

– аппаратурное оформление, включая систему контроля управления;

– технологический режим.

---

Основные технологические стадии биотехнологического процесса включают:

1. Приготовление к стерилизации питательных сред;

2. Приготовление посевного материала;

3. Культивирование;

4. Обработку культуральной жидкости;

5. Выделение и очистку биопрепарата;

6. Получение готовой продукции

1. Состав питательной среды

Состав питательной среды должен быть оптимальным, так как это определяет размножение, рост микроорганизмов и синтез различных БАВ. Питательные среды могут быть сложными, включающими до 50 компонентов и более, и достаточно простыми, содержащими не более 5 компонентов

Назначение питательных сред:

– поддержание оптимальных для роста клеток физико-химических условий (pH, еН, рО2, рСО2, и т.д.);

– обеспечение клеток питательными веществами для синтеза биомассы и других продуктов жизнедеятельности.

Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетического обмена организма (источники азота, углерода, фосфора, ряда микроэлементов, витамины, ростовые вещества), но и физикохимические к физиологические фактора (кислотность, окислительно – восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы играют существенную роль в развитии микроорганизмов и в проявлении ими отдельных физиологических и биохимических функций. Обычно изменение одного из этих факторов среды ведет к изменению других. Значительного повышения выхода нужного продукта, образуемого микроорганизмами, достигают, используя методы математического расчета соотношения компонентов субстрата и их свойства.

Питательные среды принято делить на две группы:

1. Среды, требующие внесения 5-20%природных сывороток (из крови человека или эмбриональных экстрактов крупного рогатого скота);

2. Синтетические химические среды определённого состава.

Качественная характеристика компонентов питательной среды

Основу питательных сред составляют смеси аминокислот, пуринов, пиримидинов, участвующих в синтезе белков и нуклеиновых кислот.

Сыворотки (эмбриональная сыворотка крови, лошадиная сыворотка или очищенный экстракт куриных эмбрионов), их высокомолекулярные фракции (α-, β-глобулины) предохраняют клетки от повреждения и стимулируют синтез ДНК. Синтез последних индуцируют и ростовые факторы (митогены) - вещества пептидной природы. В качестве источника углерода и энергии используется глюкоза или ее комбинации с аспарагиновой или молочной кислотами. Для развития микроорганизмов необходимы витамины жирорастворимые и водорастворимые. Жизнедеятельность микроорганизмов невозможна без наличия в цитоплазме клеток и окружающей среде неорганических соединений, содержащих такие элементы, как фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо, марганец, цинк, медь, молибден и др. Микро- и макроэлементы входят в состав ферментов, участвуют в поддержании необходимого осмотического давления и значения pH, буферной ёмкости (фосфатно- бикарбонатные буферы) или регулируют гидрофильность цитоплазмы клетки.

---

Фосфор входит в состав важнейших соединений клетки – нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полифосфатов, фосфолипидов.

Соединения серы участвую в энергетических процессах клетки, входят в состав многих физиологически активных соединений (белок и простатические группы (-SH) некоторых ферментов и коэнзима А). Без серы невозможен полноценный синтез белка, нарушаются процессы обмена. Обычно источником серы служат неорганические сульфаты, поэтому для включения серы в состав белков или витаминов сульфат должен быть восстановлен с помощью ферментов (сульфитредуктазы, сульфурилазы, пирофосфатазы). Наиболее важным серосодержащим компонентом клетки является аминокислота цистеин.

Калий в организме выполняет, прежде всего, каталитическую роль, выступая в качестве активатора некоторых ферментов (амилазы, инвертазы), способствуя увеличению гидратации цитоплазмы клетки.

Ионы кальция регулируют активную кислотность (pH среды), выступают в качестве реагента, связывающего остатки фосфорной кислоты.

Основная функция магния – активация ферментов, необходимых для нормального обмена веществ и роста микроорганизмов.

Микроэлементы (железо, медь, цинк, марганец, молибден, кобальт и др.) входят в состав ферментов, участвующих в процессах метаболизма и внутриклеточного обмена. Каталитическая активность микроэлементов возрастает во много раз, когда ионы металлов соединяются с молекулами органических веществ и образуют органоминеральные комплексы (хелаты). Железо входит в состав ферментов-активаторов кислорода – системы цитохромов. Медь в сочетании со специфическими белками образует ряд ферментных систем (полифенолоксидазы, аскарбинооксидазы, нитратредуктазы, альдегидоксидазы и др.) Цинк участвует в построении фосфатаз, эналаз, полипептидаз, регулирующих углеводный, азотистый, фосфатный обмены ряда организмов, в окислительно-восстановительных процессах. Составной частью многих ферментных систем (карбоксилаз, протеиназ, фосфорилаз) является марганец, так фосфорилазы участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Определенное влияние на различные стороны метаболизма микроорганизмов и особенно антибиотиков оказывает кобальт.

Среда содержит также небольшие концентрации, антибиотиков для поддержания асептических условий.

Перечисленные компоненты достаточно дороги, поэтому при крупномасштабном производстве прежде всего углеводы заменяют более доступными по стоимости продуктами крахмалопаточного производства (мелассой, гидролом, кукурузным экстрактом, соевой мукой, свекловичным жомом).

---

Незаменимым, элементом питательных сред является вода, которая составляет единую систему с элементами клетки. Вода-растворитель способствует проникновению в клетку необходимых, веществ и выводу из нее продуктов обмена. В клетках вода находится и в виде соединений с углеводами, белками и другими веществами, тесно взаимодействуя с макромолекулами клетки. Гидратирование и дегидратирование органических молекул – важнейший этап в превращении химических компонентов цитоплазмы. Вода участвует в реакциях гидролиза и конденсации, поддерживает объёмную структуру клетки при наличии гидростатического давления.

Для питательных сред используют специально подготовленную воду.

Очистка воды проходит 4 стадий:

1. Удаление механических загрязнений не префильтре (пористое стекло, электрокоагуляция);

2. Очистка от органических загрязнений (активированный уголь);

3. Деионизация и использованием ионообменных смол (катиониты, аниониты);

4. Стерилизация на мембранных фильтрах с размером пор от 0,22 до 0,45 мкм.

Для стерилизации питательных сред используют термическую стерилизацию (пар под давлением) в стерилизующую фильтрацию. Цель стерилизации питательных сред – разрушение бактериальных спор. Многие компоненты питательных сред (витамины, гормоны и другие БАВ) крайне чувствительны к длительному температурному воздействию, поэтому установлены специальные режимы периодической и непрерывной термической стерилизации питательных сред. Стерилизующая фильтрация предполагает использование мембранных фильтрующих элементов.

2. Приготовление посевного материала

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают в ампулах, где они законсервированы в виде чистых культур. Каждая культура имеет паспорт с описанием питательеных сред, морфологических, физиологических и других характеристик, условий для их поддержания, выращивания и срока хранения. Режим хранения культур предполагает охлаждение, замораживание или обезвоживание; во всех случаях должен быть резко сокращён или полностью прекращён картонный обмен веществ.

Культуры штаммов хранят:

– на косом агаре при температуре минус 1 — 5 °С;

– заморожены при температуре ниже – 20 °С (недопустимо повторное оттаивание и замораживание);

– лиофилизированными в ампулах, хранящимися в течение нескольких лет.

---

Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранить неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при температуре – 180 °С. Через определенное время, специфическое для каждого вида микроорганизмов и вида хранения, культуру пересеивают. Перед началом технологического процесса культуру размножают в стерильных условиях при оптимальном составе питательной среды и режиме выращивания, длительность стадии выращивания — 24 часа.

3. Культивирование

Стадия культивирования микроорганизмов является наиболее сложной и ответственной.

Рост и культивирование биомассы требуют следующих условий:

– жизнеспособности посевного материала;

– наличия источника энергии (тепла);

– достаточного количества соответствующей питательной среды;

– необходимых физико-химических условий для жизнедеятельности.

С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производства вакцины выращивали в культуре клеток млекопитающих, в том числе фибробластов эмбриона человека. С тех пор фибринобласты эмбриона стали незаменимы для выделения и выращивания ряда других вирусов, при производстве высокоспецифичных белков (антител, интерферонов), в исследованиях рака и противовирусной химиотерапии.

Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма (эмбриональных или тканей новорожденных), называют первичными культурами. В большинстве случаев клетки первичной культуры переносят из культуральной чашки и используют для получения большого количества вторичных культур, которые можно последовательно перевивать в течение недель или месяцев. Разные типы клеток нуждаются в различных питательных веществах, а также в одном или нескольких белковых факторах роста. Клеточные линии можно использовать для получения клонов, которые происходят из одной клетки-предшественника.

На рост и развитие микроорганизмов влияют внутриклеточные и внеклеточные факторы. К внутриклеточным факторам относятся: структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики. Внеклеточные (внешние) факторы, т. е. условия внешней среды клетки, являются основными регуляторными факторами биотехнологии.

Процесс начинается с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Вначале выращивают исходную культуру (5 – 10 мл), затем инкубируют ее во встряхиваемой колбе (200 -1000 мл), далее переносят в ферментер для посевного материала (10 -100 л) и далее в промышленный ферментер (1000 -100000 л). По завершении ферментации выделяемый продукт находится в клетках или в культуральной среде, но не в обеих фракциях одновременно, поэтому дальнейшие манипуляции проводят с одной из этих фракций.

---