Файл: Общая характеристика биотехнологического процесса.docx

Микроорганизмы можно выращивать:

– в ферментере периодического действия;

– в ферментере периодического действия с добавлением субстрата;

– в непрерывной культуре.

В первом случае микроорганизмы выращивают в стерильных условиях без добавления в ходе ферментации свежей культуральной среды. При периодической ферментации состав культуральной среды, концентрация микроорганизмов (биомассы), количество белкового продукта или метаболита зависят от фазы роста, клеточного метаболизма и наличия питательных веществ.

Различают шесть основных фаз роста (рис. 9)

– лаг-фаза (1);

– фаза ускорения (2);

– экспоненциальная или логарифмическая фаза (3);

– фаза замедления (4)

– стационарная фаза (5);

– фаза отмирания (6).

4. Обработка культуральной жидкости

Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ.

В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты, представляющие практическую ценность. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод.

Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от природы продуцента. Например, сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность.

Дрожжи же рода Candida, служащие источником кормового белка плохо флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме лишь в принципе отказавшись от выделения его из культуральной жидкости: содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта. Неутилизированные компоненты культуральной жидкости могут отразиться на способности продукта к хранению.

---

5. Выделение и очистка биопрепаратов

При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осаждается добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно - физическое осаждение.

Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.

Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.

Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы.

К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с последующим резким снижением давления).

Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Культуральную жидкость освобождают от сопутствующих растворимых веществ и фракционируют.

Освобождение от растворимых веществ производят несколькими способами:

1. Осаждение – физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ).

Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает 80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.

Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ

---

, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.

2. Экстракция.

При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями.

3. Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент – твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму.

Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.

Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта). По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул.

6. Получение готовой продукции

Получение готовой продукции связано с сушкой и консервированием биопрепаратов. Объект сушки - живые микроорганизмы, клетки, ферменты, гормоны и др. БАВ. Биопрепараты кроме биологически активной составляющей содержат органические соединения и значительное количество воды. Вода в продуктах биосинтеза может быть в свободном или связанном состояниях. Значительная часть воды удерживается в субстрате физико-механическими и адсорбционными связями (вандерваальсовы силы). Физико-механически связанная вода находится в порах и капиллярах материала.

---

Для высушивания биопрепаратов применяют методы, не приводящие к потере биологической активности, где доминирует сублимационная сушка (установки типа «Иней» – Россия, «Юзефруа» – Франция, «Heto – Helton» – Дания). Использование распылительных сушилок ограничено по причине сравнительно жестких условий сушки.

Термолабильные и неустойчивые по ряду показателей биопрепараты при высушивание в суспензиях (не содержащих защитных сред) подвержены существенным структурным и морфологическим изменениям. Это может сопровождаться утратой жизнеспособности и разрушением клеточных структур.

Среды высушивания (защитные среды) - криопротекторы.

Денатурирующее влияние замораживания сдерживается инактивацией (изменением свойств) защитных агентов:

– высокомолекулярных компонентов (ПВП м.м. от 2600 до 6400 – декстрин, желатин, пептон);

– низкомолекулярных и буферных компонентов (глютамат, трисбуфер).

Защитная среда предохраняет биопрепараты от необратимых изменений в процессе замораживания, высушивания и при последующем хранении. Защитные среды, как правило, состоят из нескольких компонентов. Так, для консервирования клеточных культур используют криозащитные свойства глицерина и ДМСО, их добавляют к питательной среде в концентрации 5-10%. При температуре минус 180 – 196 °С жизнеспособность законсервированной культуры может сохраняться неограниченно долго.

Розлив, укупорку, этикетировку, упаковку готовой продукции проводят в отдельных аппаратах (при малотоннажном производстве); это компактные установки для ампул, ёмкостей для инфузий; машины для укладки, упаковки.

Технологические линии (крупномасштабное промышленное производство) включают:

– УЗ – моечные машины;

– стерилизационные сушильные туннели (с ламинарными потоками горячего воздуха);

– машины для наполнения и запайки ампул;

– машины наполнения и запайки ёмкостей для растворов внутривенного введения (электронно-турбинный розлив в соответствии GMP);

– машины для наполнения и запайки порошкообразных препаратов;

– машины для наполнения и укупорки флаконов с навинчивающимся колпачком и специальной насадкой;

– наполнительные и укупорочные машины для инъекций;

– машины для нанесения кода (маркировка цветным кольцом);

– машины для контроля на герметичность;

– этикетировочные машины;

– машины для капсулирования порошков;

---

– машины для сборки, наполнения и запайки шприц-тюбиков.

Отдельные установки и технологические линии выпускают фирмы Америки, Швейцарии, Франции, Германии, Финляндии; установки этих фирм отвечают требованиям GMP (стерильная чистота в производственных помещениях).

Заключение

Перспективность и эффективность применения биотехнологических процессов в различных сферах человеческой деятельности, от получения пищи и напитков до воспроизводства экологически чистых энергоносителей новых материалов обусловлены их компактностью и одновременно крупномасштабностью, высоким уровнем механизации и производительности труда. Эти процессы поддаются контролю, регулированию и автоматизации.

Биотехнологические процессы, в отличие от химических, реализуются в "мягких" условиях, при нормальном давлении, активной реакции и невысоких температурах среды; они в меньшей степени загрязняют окружающую среду отходами и побочными продуктами, мало зависят от климатических и погодных условий, не требуют больших земельных площадей, не нуждаются в применении пестицидов, гербицидов и других чужеродных для окружающей среды агентов.

Поэтому биотехнология в целом и ее отдельные разделы находятся в ряду наиболее приоритетных направлений научно-технического прогресса и являются ярким примером "высоких технологий", с которыми связывают перспективы развития многих производств. Биологические технологии находятся в настоящее время в фазе бурного развития, но уровень их развития во многом определяется научно-техническим потенциалом страны.

Все высокоразвитые страны мира относят биотехнологию к одной из важнейших современных отраслей, считая ее ключевым методом реконструкции промышленности в соответствии с потребностями времени, и принимают меры по стимулированию ее развития.

Современные биотехнологии также остро нуждаются в научно обоснованной проработке технологии и аппаратурном оформлении.

Поэтому необходима органическая связь с техническими науками - машиностроением, электроникой, автоматикой. К биотехнологии, как ни к одной любой отрасли и области научных знаний, подходят знаменитые слова Луи Пастера: «Нет, и еще тысячу раз нет, я не знаю такой науки, которую можно было бы звать прикладной. Есть наука и есть области ее применения, и они связаны друг с другом, как плод с взрастившим его деревом».

Список литературы

1. 
   Волова, Т.Г. Введение в биотехнологию / Т.Г. Волова. – Красноярск : ИПК СФУ, 2008. – 183 с.
   
2. 
   Фауст Е. А. Основы биотехнологии / Е. А. Фауст. – Саратов : , 2015. – 52 с.
   
3. 
   Сазыкин Ю. О. Биотехнология: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева. – М.: Академия, 2008. – 256 с.
   
4. 
   Бирюков В. В. Основы промышленной биотехнологии / В. В. Бирюков, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева. – М.: КолосС, 2004. – 296 с.
   
5. 
   Елинов Н. П. Основы биотехнологии / Н. П. Елинов, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева. – СПб : Наука, 1995. – 200 с.
   
6. 
   Клунова С. М. Биотехнология: учебник / С. М. Клунова, Т. А. Егорова, Е. А. Живухина. – М. : Академия, 2010. – 256 с.
   
7. 
   Процессы в биотехнологии [Электронный ресурс]. – http://medbe.ru/materials/14.10.2021.
   
8. 
   Farmf.ru [Электронный ресурс]. https://farmf.ru/uchebniki/uchebniki-bioteh/osnovy-farmacevticheskoj-biotexnologii/. 14.10.2021.
   

---