Файл: Перечень вопросов для подготовки к экзамену по дисциплине Основы молекулярной биомедицины.pdf

Перечень вопросов для подготовки к экзамену
по дисциплине «Основы молекулярной биомедицины»
1. Дайте определение дисциплине молекулярная биомедицина и укажите,
ее основные разделы. Укажите цель дисциплины и перечислите основные
задачи. Назовите основные приоритеты развития современной
молекулярной медицины
Дисциплина основы молекулярной медицины представляет собой фундаментальную основу для изучения механизмов развития патофизиологических процессов и их коррекции. Молекулярная медицина включает в себя три раздела: 1. Молекулярная диагностика, 2. Молекулярную профилактику. 3. Индивидуальная фармакотерапия (генная терапия).
Данный курс включает в себя целостное теоретическое рассмотрение строения и функций включает в себя анализ молекул углеводов, белков, липидов, гетероциклических соединений, карбонильных соединений, биохимию нуклеиновых кислот, современные молекулярные методы, используемые для диагностики и исследования, метаболизм углеводов, пути передачи сигнала и элементарное биологическое окисление.
Целью молекулярной медицины является выявление молекулярных основ этиологии и патогенеза как наследственных, так и других заболеваний, в обеспечении предсказания генетической предрасположенности к конкретным соматическим и онкологическим заболеваниям задолго до их возникновения.
Основные задачи молекулярной биомедицины:
• идентификация генома и метаболических путей, ответственных за заболевания,
• изучение генома здоровых людей для предсказания предрасположенности здорового человека к различным заболеваниям,
• разработка молекулярной классификации болезней,
• определение индивидуальной лекарственной чувствительности
Основные приоритеты развития молекулярной медицины
• Технология «сравнительного взаимодействия», ее суть определить механизмы межклеточного взаимодействия.
Обнаружить
«каналы» взаимодействия и использовать эти знания в медицине.
• Наномедицина – теоретически позволяет доставлять лекарства в живую клетку.
• Эпигенетика – позволяет определить наличие онкологического заболевания на основе генетического теста.

• «Диффузионное изображение» - позволяет использовать технологии сканирования головного мозга для диагностики и последующего лечения таких заболеваний как шизофрения, болезнь Альцгеймера и т.п.
• «Нанобиомеханика» - рассматривает человеческое тело как машину и анализирует процессы механического взаимодействия отдельных клеток.
2. Раскройте сущность метода культивирования клеток, с какой целью он
применяется.
Культивирование клеток представляет собой метод, состоящий в выделении клеток и выращивании их in vitro, полученных из тканей или целых органов животных, микроорганизмов или растений.
Культура клеток является одним из основных инструментов, используемых в клеточной и молекулярной биологии, обеспечивая превосходные модельные системы для изучения нормальной физиологии и биохимии клеток (например, изучение метаболизма, старение), воздействия лекарств и токсичных соединений на клетки, а также мутагенеза и канцерогенеза.
3. Опишите виды микроскопии, от чего зависит разрешающая
способность микроскопа.
Существует два принципиально различных типа микроскопов – световой микроскоп и электронный микроскоп.
Разновидности световой микроскопии:

Обычная световая микроскопия

Ультрафиолетовая микроскопия

Люминесцентная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия

Темнопольная микроскопия

Интерференционная микроскопия

Поляризационная микроскопия
Разновидности электронной микроскопии
• Трансмиссионная микроскопия
• Сканирующая микроскопия:
- растровая электронная микроскопия (отображает исследуемый объект за счет тонкого сфокусированного электронного пучка (зонда), который формируется и осуществляет сканирование при помощи колонны микроскопа.)
- зондовая сканирующая микроскопия

- атомно-силовая сканирующая микроскопия
Разрешающая способность микроскопа является наиболее важной характеристикой оптической системы и определяет еѐ способность различать мелкие детали исследуемого образца.
4. Сущность метода ПЦР.
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЦР используют для амплификации определенного фрагмента ДНК из сложной смеси исходного материала, обычно называемого ДНК-матрицей, и во многих случаях для ПЦР нет нужды в высокой степени очистки ДНК.
5. Объясните сущность и области применения метода секвенирования.
Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК или полных геномов организмов.
Для секвенирования нуклеиновых кислот применяют следующие методы:
1 Секвенирование по Сенгеру;
2 Пиросеквенирование;
3 Бисульфитный метод;
4 Метод Маскама и Гилберта (химический метод);
5 Секвенирование нового поколения (NGS);
6. Опишите сущность метода гибридизации и ДНК-зондов.
Метод основан на специфическом взаимодействии (гибридизации) двух образцов ДНК: меченого ДНК-зонда и участка плазмидной или хромосомной
ДНК. Образовавшиеся двухцепочечные ДНК отделяют от одноцепочечных и определяют присутствие метки. В качестве контроля используют ДНК известного штамма микроорганизма. Степень реассоциации таких гомологичных одноцепочечных ДНК принимают условно за 100 %. При 60-
100 % гомологии ДНК можно говорить о принадлежности сравниваемых бактерий к одному виду.

Разработаны два способа гибридизации: в растворе или с использованием нерастворимого носителя. Гибридизация на носителях применяется значительно шире: анализируемый образец связывается с нитроцеллюлозным или нейлоновым фильтром.
Существует несколько разных методов мечения комплекса между зондом и
ДНК-мишенью. Традиционным способом является радиоактивное мечение зонда с помощью введения в ДНК радиоактивных изотопов 33Р, 32Р, 35S.
После гибридизации образцы-мишени выявляют с помощью радиоавтографии. Этот метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать около 1 пг ДНК. Недостаток радиоактивных зондов
— их нестабильность из-за непродолжительного времени жизни изотопов (32Р
— 14,5 сут) и быстрого радиолиза зонда. Использование изотопов с более продолжительным периодом полураспада приводит к снижению чувствительности и удлиняет время, необходимое для радиоавтографии.
Кроме того, для работы с изотопами необходимы специально оснащенные лаборатории.
Наиболее широко используют нерадиоактивное мечение.
Для нерадиохимической детекции применяют методы, основанные на присоединении к зондам остатков биотина. Метод обладает более низкой чувствительностью, чем радиохимический. Повысить чувствительность можно, увеличив число остатков биотина, введенных в зонды.
Метод дот-гибридизации. В случаях, когда необходимо установить наличие или отсутствие в ДНК выявляемой последовательности, применяют метод дот-гибридизации. В этом случае очищенную денатурированную ДНК наносят непосредственно на фильтр, иммобилизуют, гибридизируют с зондом и регистрируют на автографах положительные сигналы.
Методы ДНК (или РНК)-зондов основаны на реакции гибридизации нуклеиновых кислот — способности односпиральных комплементарных цепей ДНК или РНК формировать двуспиральные структуры. Реакция может протекать между комплементарными молекулами вида: ДНК + ДНК, ДНК +
РНК, РНК + РНК.
Методы ДНК-зондов сводятся к следующему:
- Получение односпирального фрагмента ДНК определенного вируса и его метки — это ДНК-зонд;
- выделение из исследуемого материала нуклеиновых кислот и их денатурация;
- контакт образовавшихся односпиральных молекул ДНК (или РНК) с ДНК- зондом при 55—65 °С, приводящих к образованию двуспиральных молекул
(гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности;

- удаление всех негибридизированных односпиральных молекул нуклеиновых кислот (отмывают или добавляют нуклеазы);
- обнаружение (по метке) образовавшихся двуспиральных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в исследуемом материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.
Если использовали радиоактивный зонд, то результаты учитывают методом авторадиографии или путем подсчета импульсов в счетчике.
Методы ДНК (РНК)-зондов из диагностической практики постепенно вытесняются новым методом — полимеразной цепной реакцией.
7. Дайте определение и опишите принцип метода клонирования генов.
Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- и эукариотических. Эти клетки, содержащие нужный ген, можно использовать для получения: а) большого количества белка, кодируемого данным геном; б) большого количества самого гена в высокоочищенном виде.
Процесс клонирования генов включает в себя несколько стадий:
1. Получение необходимого гена: а) путем расщепления геномной ДНК с помощью рестриктаз
(эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенном месте); б) путем химического синтеза только небольших фрагментов ДНК (так как зная последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле, можно всегда определить последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК, кодирующем данный белок, в соответствии с генетическим кодом). Так, путем химического синтеза был получен ген, ответственный за синтез соматостатина; в) из клеток организма выделяют молекулы иРНК и с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНК-по-лимераза) снимают ДНК- копии необходимого гена. Например, из островных клеток поджелудочной железы были выделены иРНК, несущие информацию о синтезе инсулина. А из клеток, инфицированных вирусами, выделены и РНК, несущие информацию о синтезе интерферона.
2. Ввод выделенного или полученного фрагмента ДНК в состав векторной молекулы ДНК – получение рекомбинантной ДНК. Вектор – это нечто вроде молекулярного «такси», способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла там реплицироваться. Существует два основных типа векторов: бактериальные

плазмиды (чаще ответственные за устойчивость к двум и более антибиотикам) и умеренные дефектные (способные к осуществлению трансдукции) бактериофаги. Плазмиду расщепляют с помощью рестриктазы в сторого определенном месте. После расщепления ее концы, как и концы выделенной для клонирования ДНК, с помощью концевой трансферазы «доращивают» так, чтобы концевые участки плазмиды были комплементарны встраиваемой
ДНК (или еще говорят «липкими»). Далее, благодаря взаимодействию
«липких» последовательностей и с помощью специальных ферментов ДНК- лигаз осуществляют сшивку (лигирование) ДНК-вставки и плазмидной ДНК.
Полученная в результате новая кольцевая молекула ДНК называется уже рекомбинантной ДНК.
3.Ввод рекомбинантной ДНК в состав клетки-реципиента. Клетки, выбранные для клонирования генов могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их культивирование не представляет большой проблемы (E. coli,
В. subtilis и др.). Но если ген выделен по методике 1, то его необходимо клонировать в клетках эукариотов, например, дрожжей. Ввод рекомбинантной
ДНК осуществляют путем трансформации (проницаемость клеточной стенки бактерий увеличивается в разбавленном растворе хлористого кальция) или трансдукции (в случае использования в качестве вектора бактериофага).
4.Отбор трансформированных клеток. Поскольку не все бактериальные клетки в реакционной смеси будут трансформированы, необходимо произвести отбор клеток, содержащих рекомбинантные бактерии. Отбор обычно основан на том, что плазмиды обеспечивают резистентность к тем или иным антибиотикам, а, следовательно, бактерии, содержащие плазмиды, будут размножаться в присутствии соответствующего антибиотика.
5. Культивирование трансформированных клеток. Культивирование отобранных клеток необходимо для наращивания биомассы с целью амплификации генов в клетках-реципиентах.
6. Выделение белкового продукта гена или выделение встроенной ДНК из очищенных плазмид.
8. Перечислите методы иммунохимического анализа и укажите их
преимущества перед другими методами.
Наиболее известными методами иммунохимического анализа являются:

Иммуноферментный анализ с колориметрической детекцией;

Иммуноферментный анализ с хемилюминесцентной детекцией;

Иммуноферментный анализ с флуоресцентной детекцией;


Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ;

Электрохимический иммуноанализ;

Проточно-инжекционный анализ;

Иммуноанализ с использованием каппилярного электрофореза;

Тест-системы на основе иммуноафинных колонок;

Имуунохроматографический анализ;

Метод «Bar-code»;

Мультопараметрический «сендвич»-анализ
Иммуноферментный и другие варианты иммуноанализа основаны на взаимодействии антигена с антителом, то есть реакции антигенных детерминант с антигенсвязывающим фрагментом антител.
При сравнении иммунохимического анализа, основанного на реакции антиген–антитело, с другими аналитическими методами целесообразно отметить ряд преимуществ иммуноаналитических методов:
- обнаружение целевого аналита, либо группы сходных по структуре соединений в широком диапазоне определяемых концентраций;
- невысокая стоимость одного анализа;
- возможность использования для быстрого скрининга за счет одновременного анализа нескольких проб;
- экономическая эффективность методов;
- быстрота и простота анализа и, следовательно, высокая производительность;
- отсутствие высокотехнологичного оборудования;
- невысокие требования к квалификации оператора, возможность быстрого обучения;
- возможность использования во внелабораторных условиях, организации мониторинга в полевых условиях.
9. Назовите методы определения строения белков.
Для определения первичной структуры белка прежде всего разделяют его полипептидные цепи, затем определяют аминокислотный состав цепей,
N- и С-концевые аминокислотные остатки и последовательность аминокислот.
Полипептидные цепи подвергают специфическому расщеплению протеолитическими ферментами (например, трипсином, который гидролизует связи по остаткам лизина и аргинина, или протеазой из
Staphylococcus aureus, гидролизующей связи по остаткам глутаминовой кислоты) или химическими реагентами
(например, бромцианом, расщепляющим связи, образованные остатками метионина, гидроксиламином
– между остатками аспарагина и глицина).

Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотную последовательность. Основным методом исследования аминокислотной последовательности пептидов и белков является их деградация с помощью фенилизотиоцианата (метод Эдмана); при происходит последовательное отщепление N-концевых аминокислотных остатков в виде фенилтиогидантоинов, которые поглощают свет в УФ-области с максимумом поглощения 265–270 нм. С помощью специального прибора – секвенатора – удаётся осуществить автоматическое отщепление и идентификацию фенилтиогидантоинов.
Для этих же целей применяют масс-спектрометрию. В последние годы для установления первичной структуры белков в основном пользуются данными о последовательности нуклеотидов в их структурных генах. Для определения содержания канонических элементов вторичной структуры в белках используют методы кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения.
О пространственном расположении атомов в молекуле белка судят на основании рентгеноструктурного анализа его кристаллов. С помощью дифференциальной спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния и флуоресценции изучают изменение конформации белка в процессе функционирования или при изменении внешних условий. Прямую информацию о пространственном строении белка в растворе даёт метод ядерно-магнитного резонанса.
10. Объясните сущность масс-спектрометрических методов анализа.
Масс-спектрометрия – один из самых востребованных методов физико- химического анализа, который предполагает перевод молекул исследуемых компонентов анализируемого образца в ионизированное состояние, последующее эффективное разделение образовавшихся как положительных, так и отрицательных ионов и их надежную регистрацию.
11. Объясните сущность и укажите разновидности хроматографических
методов анализа.
Основные методы хроматографии, применяемые в молекулярной медицине

Эксклюзионная (ситовая) хроматография

Ионообменная хроматография

Тонкослойная хроматография
Газовая хроматография
Газовая хроматография используется во многих областях медицины и биологии: в гигиене и экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах; в токсикологии и судебной