Файл: Отчет защищен с оценкой 07 августа 2021 г Руководитель образовательной программы.docx

декапитации, электрического тока и т.д.;

б) быстрое вскрытие животного, извлечение необходимых органов и тканей, из которых острым инструментом вырезают небольшие кусочки (5-10 мм³), помещение их в фиксатор;

в) объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого объекта в 20-40 раз; применяемый фиксатор может простым (спирт, формалин, ацетон) и сложным, состоящим из 2-х и более компонентов (жидкость Карнуа: абсолютный спирт, хлороформ, ледяная уксусная кислота);

2. 
   промывание, обезвоживание и заливка биологического материала:
   

а) промывание кусочка ткани под проточной водой в течение 12-24 часов для освобождения от излишков фиксатора; для объектов, фиксированных в спирте или жидкости Карнуа, этот этап пропускают;

б) обезвоживание и уплотнение в батарее спиртов возрастающей крепости (50 % => 60 % => 70 % => 90 % => 96 % => 100 %);

в) просветление кусочка посредством помещения в смесь абсолютного спирта и орто-ксилола (1:1), затем в две-три порции чистого орто-ксилола;

г) после просветления пропитывание материала в парафине, используя термостат: сначала в смеси орто-ксилола и парафина (1:1) при температуре 37 градусов, а затем в 2-3 порциях чистого парафина, расплавленного при температуре 56 градусов;

д) наклеивание пропитанного парафином кусочка на деревянный блок;

3. 
   приготовление гистологических срезов с помощью ротационного микротома; наклеивание полученных гистологических срезов на предметное стекло, предварительно смазанное смесью белка и глицерина (1:1) и сушка на воздухе либо в термостате при 37 градусах;
   
4. 
   окрашивание и заключение срезов:
   

1. 
   Сухие и частично дегидратированные препараты насытить водой в серии спиртов понижающихся концентраций.
   
2. 
   Поместить стекла на 1–5 мин в 2х PBS.
   
3. 
   Нанести на препарат 500 мкл блокирующего раствора, поставить во влажную камеру и инкубировать 30–60 мин при 4°С.
   
4. 
   Стряхнуть блокирующий раствор и нанести 200 мкл раствора I антител. инкубировать во влажной камере 60-120 мин.
   
5. 
   Отмывать в 3 сменах 2х PBS;
   
6. 
   Нанести на препарат 200 мкл раствора II антител, поставить в темную влажную камеру и инкубировать 40–60 мин.
   
7. 
   Отмывать в 3 сменах 2х PBS;
   
8. 
   Нанести на препарат краситель DAPI
   
9. 
   Отмывать в 5 сменах 2х PBS;
   
10. 
    Заключить препарат в фотозащитную среду и исследовать под микроскопом
    

1.4 Ход работы (фактическая информация о методе)

1. 
   взятие и фиксация биологического материала:
   

а) предварительная эвтаназия лабораторной мыши диэтиловым эфиром в эксикаторе; вскрытие с помощью ножниц и изъятие необходимого материала (кусочек мозжечка) с помощью пинцета; помещение объекта в фиксирующую среду (4%-ный формалин) на час;

---

2. 
   промывание, обезвоживание и заливка биологического материала;
   

а) промывка объекта последовательной сменой фофатно-солевых буферов (PBS) три раза по тридцать минут; проводка объекта через батарею спиртов с возрастающей концентрацией (50 %=> 60 % => 70 % => 80 % => 90% => 95 %) по 30 минут на каждый спирт;

б) замена спирта в ткани на изопропанол последовательной сменой смесей этанол : изопропанол (3:1), этанол : изопропанол (1:3) по 30 минут на каждую смесь; помещение объекта в чистый изопропанол на ночь; последовательная замена изопропанола на парафин в термостате при 65 градусах с помощью растворов изопропанол : парафин (1:1) на полтора часа, парафина I и парафина II по 2 часа на каждый;

в) заливка будущего гистологического препарата в парафиновые блоки на ночь;

3. 
   приготовление гистологических срезов:
   

а) приклеивание парафинового блока к пластмассовой конструкции, прямо перед этим залитой избытком парафина;

б) закрепление парафинового блока на микротом и его нарезка;

в) помещение полученного парафинового среза в гистологическую ванну, содержащую воду с температурой 37 градусов для последующего расправления препарата;

г) помещение среза на предметное стекло при помощи пинцета, сушка на гистологическом столике;

4. 
   окрашивание срезов:
   

б) после сушки на гистологическом столике последовательное депарафинирование при помощи следующих соединений: ксилол I (10 минут), этанол I 90 % (5 минут), этанол 80 % (5 минут), этанол 70 % (5 минут), этанол 60 % (5 минут), этанол 50 % (5 минут), раствор PBS (5минут);

в) окрашивание в антителах:

окантовка препарата гидрофобным маркером;

блокировка неспецифичных взаимосвязей 3% обезжиренным раствором сухого молока во влажной среде в +4ºС;

Окрашивание антителами I в течение 2-х часов, затем отмывание в растворе PBS 3 раза по 5 минут

окрашивание антителами II в течение 1 часа.

Отмывание в растворе PBS 5 раз по 5 минут

Окрашивание ядер красителем DAPI

Отмывание в растворе PBS 5 раз по 5 минут

г) наклеивание фотозащитного стекла

Вывод

В результате проведенной работы было проведена декапитация усыпленной диэтиловым эфиром лабораторной мыши и ее вскрытые с аутопсией мозжечка.

В процессе проведения работы по приготовлению гистологического препарата был получен продольный срез ткани мозжечка толщиной 6

микрометров и окрашен антителами специфичными на актин и бетатубулин.

---

Так, синим цветом на микроснимке окрашены ядра, зеленым – микротрубочки, красным - микрофиламенты
6. Работа с белками плазмы крови и мышц лабораторной мыши. Электрофорез в полиакриламидовом геле.

1 Электрофорез

Электрофорез — это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля.

            Электрофорез в гелях является «Золотым стандартом» в электрофорезе. В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агар-агаровый или полиакриламидный гели. Характерной особенностью этой разновидности зонального электрофореза является его высокая разрешающая способность, поскольку гели функционируют как молекулярные сита: крупные молекулы проходят сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле

2 оборудование и материалы:

Оборудование

1. Камера для вертикального электрофореза

2. Комплект оборудования для формирования геля.

3. Центрифуга (10000g).

4. Химические колбы, стаканы, пластиковые пробирки на 5 и 50 мл, автоматические пипетки-дозаторы регулируемого объема

Реактивы

1. 
   0,5 M трис-HCl, pH6,7 (1.25 мл)
   
2. 
   30% АА-МБА (0.75 мл)
   
3. 
   0,1 M ЭДТА (0.1 мл)
   
4. 
   50% глицерин (0.5 мл)
   
5. 
   10% ДСН (0.05 мл)
   
6. 
   1,5 M трис-HCl, pH8,9 (5 мл)
   
7. 
   краситель Кумасси
   
8. 
   ТЕМЕД
   
9. 
   1% ПСА
   
10. 
    Раствор трисс-глицина
    
11. 
    SDS
    
12. 
    МЭ
    
13. 
    Раствор для солюбилизации образцов
    
14. 
    Фиксирующий раствор
    

3. Ход работы (унифицированная информация о методе):

1. 
   изъятие биологического материала и его гомогенизация вручную посредством продавливания клеток через зазор;
   
2. 
   забор гомогенизированного материала дозатором и внесение его в пробирку, добавление в пробирку буферного раствора в объеме в два-три раза больше объема ткани;
   
3. 
   экстракция белка при помощи центрифуги нием при 10000-20000 оборотах в минуту в течение 5-ти минут;
   
4. 
   забор всей надосадочной жидкости (супернатанта) из пробирки и помещение ее в новую пробирку, слив полученного осадка в лабораторные отходы;
   

5. 
   электрофорез белков по Лэммли в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (ДСН);
   

6. 
   приготовление двух гелей: концентрирующего и разделяющего;
   

---

7. 
   приготовление и добавление в камеру для электрофореза 10%-ного раствора додецилсульфата натрия, а также буфера для концентрирующего геля с pH 6,8 и буфера для разделяющего геля с pH 8,8;
   

8. 
   фиксация результатов электрофореза ледяной 100%-ной уксусной кислотой;
   

9. 
   окрашивание разделенных белков красителем Кумасси синий в течение 15-ти минут;
   

10. 
    промывание результатов электрофореза 7%-ной уксусной кислотой по 15 минут на каждое промывание до устойчивого проявления окрашенных полос белков.
    

4.Ход работы (фактическая информация о методе):

1. 
   Взятие материала у предварительно умервщленной лабораторной крысы (см. пункт Иммуногистохимия)
   
2. 
   Доводим концентрацию до 2мг/мл:
   

1. 
   50мкл концентрированного белкового раствора помещаем в пластиковую пробирку для микропроб
   
2. 
   Анализируем концентрацию с помощью спектрофотометра
   
3. 
   Разбавляем раствором PBS до конечной концентрации 2мг/мл (кровь 1:14, мышцы 1:6)
   
4. 
   Центрифугируем при 300g 5 минут и собираем надосадочную жидкость
   

3. 
   Собираем конструкцию
   

Сборка установки для электрофореза: скрепляем специальные стекла между собой, чтобы получить герметичную пластину, в которую будем заливать гели.

4. 
   Приготовление разделяющего геля
   

1. 
   Готовим 20 мл раствора для формирования разделяющего геля:
   

• 
  1,5 М трис-HCl, pH8,9 (5 мл)
  
• 
  30% АА-МБА (6 мл)
  
• 
  0,1 М ЭДТА (0,4 мл)
  
• 
  50% глицерин (2 мл)
  
• 
  10% ДСН (0,2 мл)
  
• 
  Довести объем водой (до 19 мл)
  
• 
  ТЕМЕД (10 мкл)
  
• 
  1% ПСА (1 мл)
  

2. 
   Заливаем в гелевую ячейку, прибавляя гель с правой стороны
   
3. 
   По каплям(но быстро) с левой стороны прибавляем бутанол(100 мкл) для формирования ровной верхней границы геля.
   
4. 
   Оставляем гель в покое для прохождения полимеризации.
   
5. 
   После полимеризации бутанол быстро смываем
   
6. 
   Воду удалить перевернув камеру, небольшой остаток оставить, чтобы не сох верхний край геля
   
7. 
   Перед заливкой концентрирующего геля, скорость полимеризации которого должна быть выше и процесс должен проходить за 10 минут, избыток воды лучше удалить полоской фильтровальной бумаги, перевернув камеру на боковой торец (на 90°)
   

5. 
   Приготовление концентрирующего геля):
   

1. 
   Готовим 10 мл:
   

• 
  0,5 М трис-HCl, pH6,7 (2,5 мл)
  
• 
  30% АА-МБА (1,5 мл)
  
• 
  0,1 М ЭДТА (0,2 мл)
  
• 
  50% глицерин (1 мл)
  
• 
  10% ДСН (0,1 мл)
  
• 
  Довести объем водой (до 9 мл)
  
• 
  ТЕДЕМ (10 мкл)
  
• 
  1% ПСА (1 мл)
  

---

2. 
   Добавляем концентрирующий гель и накрываем гребнем. после застывания геля гребень вынимаем.
   
3. 
   Пластины с гелем устанавливаем в держатель для геля.
   
4. 
   Держатель устанавливаем в установку для электрофореза.
   

6. 
   В пространство между двумя гелями заливаем до краев раствор Running Buffer (общий объем 500мл) смешанный с SDS (общий объем 5мл). Оставшийся раствор вливаем в установку, в которой вставлены наши пластины.
   
7. 
   В ячейки концентрирующего геля вносим по 10мкл:
   

• 
  В крайние - стандарт (итого 4 ячейки)
  

• 
  Между стандартами на одной стороне только белки мышц (итого 8 ячеек)
  
• 
  На другой – белки плазмы крови (итого 8 ячеек)
  

8. 
   Запускаем электрофорез при 22мА на 1.5 часа
   
9. 
   Фиксируем результаты электрофореза в 7% уксусной кислоте и окрашиваем белки красителем кумасси.
   
10. 
    Отмываем гели до проявления пятен электрофореза: заливаем кипяток и ставим на мешалку на 10 минут. Повторяем.
    

6. 
   ВЫВОД
   

В ходе проведения опыта была получена лестница разделения смеси белков, которая была сравнена со стандартной лестницей молекулярных масс белков. Это позволило ориентировочно судить о том, какие белки присутствуют в плазме крови (далее приведены белки и их молекулярная масса):

• 
  глобулин – 193 кДа;
  
• 
  альбумины – от 62 до 75 кДа;
  

белки мышц:

• 
  тропомиозин – 63 кДа
  
• 
  тропонин – 37 кДа
  
• 
  актин (развалился) – от 46 до 37 кДа
  
• 
  меромиозин тяжелый – 216 кДа
  
• 
  меромиозин легкий – 98 кДа
  

Полученный результат был оцифрован посредством системы документирования и анализа результатов электрофореза ChemiDoc Touch (Приложение В, Рисунок В.2).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе практики по получению первичных профессиональных умений и навыков, в том числе первичных умений и навыков научно-исследовательской деятельности (Биологическая) исследованы и изучены следующие методы:

• 
  pH-метрия растворов;
  
• 
  взятие и фиксация аутопсийного материала;
  
• 
  приготовление питательной среды;
  
• 
  центрифугирование;
  
• 
  электрофорез белков в полиакриламидном геле;
  
• 
  приготовление гистологических препаратов.
  

В ходе учебно-ознакомительной практики были выполнены следующие задачи:

1. Подготовка объектов и освоение методов исследования, применяемых в биохимической лаборатории. Были теоретически освоены следующие методы:

• 
  подготовка реагентов для приготовления буферных растворов;
  
• 
  калибровка и использование pH-метра;
  
• 
  приготовление пектиновых гелей разной степени этерификации;
  
• 
  взятие и фиксация аутопсийного материала;
  
• 
  стерилизация использованных лабораторных инструментов и растворов;
  
• 
  приготовление культуральной среды;
  
• 
  теоретическое освоение электрофореза белков в полиакриамидном геле;
  
• 
  приготовление гистологических срезов.
  

---