ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 12.11.2024
Просмотров: 30
Скачиваний: 0
Основные понятия и история развития генетической инженерии.
В 1966г Ниренберг, Корана и Очоа расшифровали генетический код и выделили Ф (лигазы и рестиктазы), участвующие в метаболизме НК. Впоследствии, благодаря этому люди узнали какие гены отвечают за те или иные свойства и получили возможность воздействовать на структуру ДНК и изменять ее по своему разумению.
Датой основания ГИ считается 1973 год. В это время Берг, Боер и Коэн создали первую рекомбинантную ДНК, содержащую фрагменты вируса SV40, бактериофгаи лактозного оперона Е. Коли. Через 10 лет после этого были созданы трансгенны растения, позднее – мыши, а через 20 лет – овцы.
Биотехнология рекомбинантных ДНК:
рестрикция ДНК;
Рестрикция – специфическое расщепление ДНК высокоспецифичными рестриктазами для получения отдельных фрагментов ДНК и генов.
Рстриктазы узнают определенные последовательности азотистых оснований, т.н. сайты рестикции.
Их выделяют из бактерий. Реже из дрожжей и водорослей. Естественной функцией рестриктаз является защита бактерий от чужеродной ДНК. В названиях рестиктаз указывается: род микроорганизма, вид и порядковый номер. Иногда указывается четвертая буква, обозначающая штамм. В настоящее время известно более 2000 рестриктаз, узнающих боле 150 сайтов рестрикции.
методы секвенирования ДНК;
Секвенирование– определение нуклеотидной последовательности ДНК. С его помощью можно быстро определить нуклеотидную последовательность длиной 100-500 нуклеотидных пар. Это необходимо для выяснения структуры и функций полученных фрагментов. Существует 2 метода: химический и энзиматический.
Химический методбыл предложен в 1976г Максамом и Гилбертом. Один из концов ДНК метят изотопом фосфора. Далее расщепляют цепь и с помощью электрофореза смотрят последовательность секванируемой ДНК.
Энзиматический метод. Разработан Сэнгером. В основе лежит реакция с ДНК-полимеразой. Полученный фрагмент используется в качеств матрицы и многократно копируется. Продукты реакции анализируют электрофорезом и считывают последовательность радиографом.
На сегодняшний день расшифрованы нуклеотидные последовательности не только про- и эукариот, но и геномы многих организмов. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка.
гибридизация и использование ДНК-зондов;
Гибридизация– метод выявления специфических нуклеотидов. В ГИ используется для анализа гибридных молекул ДНК. Весьма чувствителен для выявления определенных последовательностей ДНК и РНК.
Этот метод основан на способности азотистых оснований образовывать комлиментарые пары. Если солевой раствор ДНК нагреть до 100гр и повысить рН до 13, ДНК денатурирует, т.е. распадается на 2 цепи. При снижении температуры до 65гр структура двойной спирали восстанавливается, но только с комплиментарными цепочками.
Для теста необходимо иметь одно-цепочный фрагмент ДНК, комплиментарный той последовательности ДНК, которую мы хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо химическим синтезом и носит название ДНК-зонд. Может содержать 15-1000 нуклеотидов и чаще всего метится изотопом фосфора, по которому находят нужные фрагменты в электрофорограмме.
клонирование ДНК. Типы векторов;
Методами клонирования применяются для того чтобы фрагменты ДНК любого вида можно было ввести в плазмиду или бактериофаг, получив т.о. вектор, а затем размножить эти генетические элементы в клетках бактерий или дрожжей, увеличивая их число в миллионы раз. Методы основаны на двух подходах:
Использование бактериальных и дрожжевых кл для размножения введенной в них чужеродной ДНК (клонирование ДНК ин виво) и создание геномных библиотек
Амплификация ДНК ин витро
Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).
Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома. Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком. Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.
Амплификация ДНК ин витро.
Амплификация проводится не внутри клетки, а в пробирке, с помощь. Химических методов: ПЦР, лигазной цепной реакции, NASBA-метода.
В 1985г Кэри Мюллис ехал по клифонийскому шоссе и ему пришла на ум идея: как можно было бы скопировать один участок ДНК миллионы и миллиарды раз? Ветящиеся потоки машин, проскальзывающие мимо друг друга и расходящиеся в разные стороны натолкнули его на одну мысль. Он остановился и начал чертить линии: удвение ДНК в пробирке. По его расчерам 20 периодов достаточно чтобы одиночная ДНК произвела миллион идентичных молекул. На следующий же день он опробовал свою идею и она сработала, но потрясены были лишь немногие коллеги. Идея была слишком простая. Наверняка уже кто-то это пробовал. Немного позже, на одном из конгрессов, Нобелевский лауреат Леденберг, один из основоположников генной инженерии изучил материалы Мюллиса и как бы невзначай спросил: «Это работет?», Мюллис ответил утвердительно и, наконец, получил заслуженную реакцию: «икона» мол генетики начал рвать на себе волосы и восклицать: «Почему я до этого не додумался!?!»
И тк, Мюллис совершил революцию… в пробирке. Он разработал принцип, носящий название ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ, он имитирует деление клетки, тот момент, когда спираль ДНК распадается на 2 цепи и каждая из цепей себя достраивает при помощи днк-полимеразы.
Для того чтобы развернуть ДНК в пробирке, ее нагревают до 94гр, а для синтеза снова охладить. В дальнейшем из бактерий термус акватикус, обитающих в термальных источниках, была выделена и несколько модифицирована полимераза, способная функционировать при высоких температурах и не теряющая своей активности при перепадах температуры. На сегодняшний день ее производят в больших количествах.
Таким образом при трехминутных циклах можно за один час произвести 1 млн копий ДНК.
ПЦР бесценна не только в науке, но и в диагностике. Вирусы и бактерии быстро обнарудиваются и не требуется длительного выращивания. В криминалистике появилась возможность размножать ДНК, оставленную преступником, а затем делать ДНК-диагностику.
Кэри Мюллис получил Нобелевскую премию в 1993 году.
Для лигазной ЦР используют другой фермент: термостабильную ДНК-лигазу.
На сегодняшний день NASBA-метод является наиболее универсальным. В отличие от ЦР проводится при температуре 41нр, применяются други фрменты. Метод крайне чувствительный, применяется для контрля пищевых продуктов, мед диагностике, суд-мд экспертизе.
Введение нового (рекомбинантного) гена в клетку осуществляется двумя способами: при помощи вектора и путем прямого введения.
Вектор – молекула ДНК или РНК, способная переносить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплецируются автономно или после интеграции с геномом.
Вектор должен обладать следующими свойствами:
Способность автономной репликации, независимо от хромасомы реципиента.
Наличие области, к которую возможно встраивание необходимого фрагмента ДНК. Для этого вектор должен содержать один или более чувствительных участков, чувствитльных к определенным ретриктазам, которые разрезают вектор и позволяют фрагменту ДНК встроиться.
Небольшой размер
Наличие маркерных генов для дальнейшего контроля. Эти гены могут вызывать устойчивость к определенным антибиотикам или стимулировать синтез окрашенных веществ.
Наличие соответствующего промотора (участка гена, запускающего транскрипцию) под который надо поместить необходимый нам ген для его экспрессии.
Таким образом вектор – целая генетическая конструкция, в состав которой помимо трансгена входят макерные гены и соответствующи регуляторные последовательности. Типы векторов:
Плазмиды. Бактериальные, внехромасомные, кольцевые последовательности ДНК, способные автономно реплецироваться. У бактерий играют защитную и адаптационную роли. Недостаток плазмид их большой размер.
Вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую. К таким относятся ДНК-вирусы SV-40 и вирус полиомы. Внедрение некоторых опухолевых РНК-вирусов ведет к отпочковыванию вирусных частиц от клетки без ее лизиса. К таким вирусам относятся, например, ретровирусы (вирус саркомы Рауса и СПИДа). Для бактериальных клеток в качестве вектора часто используют бактериофаги.
Вирусы являются одними из главных кандидатов на роль векторов для введения чужеродной ДНК. При вирусной инфекции каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования.
Вирус должен быть жизнеспособным после рекомбинирования его ДНК. Легче всего вирусы вводятся в бактерии. Недостатком вирусов как векторов является их небольшая емкость. Кроме того, вирусы заражают небольшой круг хозяев.
Транспозоны – сегменты ДНК, которые контролируют собственное перемещение из одного сайта ДНК в другой путем выхода из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромасомы или плазмиды. Они как бы передвигаются по всему геному растения. Были открыты у кукурузы, но со временем их обнаружили у бактерий и дрозофил. Механизм их движения до конца не ясен.
Метод очень эфективен. С его помощью можно встраивать довольно крупные фрагменты.
векторные системы предназначенные для клонирования крупных фрагментов ДНК:
космиды – объединяют в себе участки плазмидных ДНК (маркер и репликон) и ДНК бактериофага.
Фазмиды – также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды.
Бактериальная искусственная хрмасома
Дрожжевая искусственная хромасома
Прямой перенос генов в клетку
При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.